厭氧氨氧化(anaerobicammoniumoxidation，Anammox)可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)硝化反硝化工藝去除污水中的氮，具有能耗低、產(chǎn)泥量少、無(wú)需外加碳源和運(yùn)行成本低等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是最有前途的生物脫氮工藝之一。由于厭氧氨氧化生長(zhǎng)緩慢，倍增時(shí)間長(zhǎng)，工程上采用生物膜或顆粒污泥形態(tài)持留厭氧氨氧化菌(anaerobicammoniumoxidationbacteria，AnAOB)，以保證系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行。目前，厭氧氨氧化工藝已成功應(yīng)用于污泥厭氧消化上清液等高濃度氨氮污水處理中。由于城市污水具有氨氮濃度低、溫度低等特點(diǎn)，限制了厭氧氨氧化的主流應(yīng)用。為提高AnAOB活性，通常采用投加FeS、Fe(Ⅲ)、納米零價(jià)鐵(nZVI)、羥胺(NH2OH)、肼(N2H4)、石墨烯以及生物炭等輔助材料。其中，N2H4作為厭氧氨氧化代謝中間產(chǎn)物受到廣泛關(guān)注。N2H4可以通過(guò)抑制其他細(xì)菌生長(zhǎng)，降低與AnAOB對(duì)底物的競(jìng)爭(zhēng)，同時(shí)為AnAOB的生長(zhǎng)提供額外能量，減少NO3--N的產(chǎn)生，從而提高厭氧氨氧化反應(yīng)器脫氮性能。
YAO等研究表明，當(dāng)加入3.99mg·L-1的N2H4時(shí)，CANON系統(tǒng)中顆粒污泥的厭氧氨氧化活性增加，當(dāng)N2H4質(zhì)量濃度為4.86mg·L-1時(shí)，可以緩解NO2--N對(duì)AnAOB活性的抑制。MIODOŃSKI等添加了3.7mg·L-1的N2H4后，在高基質(zhì)濃度條件下厭氧氨氧化系統(tǒng)在42d內(nèi)完成了快速啟動(dòng)，平均氮負(fù)荷率(nitrogenloadingrate，NLR)比對(duì)照組高2倍。蔡慶等通過(guò)批式實(shí)驗(yàn)研究N2H4對(duì)高基質(zhì)濃度下(NH4+-N約225mg·L-1，NO2--N約280mg·L-1)厭氧氨氧化顆粒污泥的短期影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)N2H4質(zhì)量濃度在1.8~9.5mg·L-1時(shí)，厭氧氨氧化活性明顯增加。XIANG等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)N2H4質(zhì)量濃度為2~5mg·L-1時(shí)，純顆粒污泥和絮體-顆�；旌衔勰嗟姆磻�(yīng)器均可保持長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月的穩(wěn)定高效運(yùn)行，但純顆粒污泥系統(tǒng)具有更高效的性能，總氮去除速率(totalnitrogenremovalrate，TNRR)達(dá)到(0.33±0.04)g·(L·d)-1。可見(jiàn)，N2H4對(duì)AnAOB活性的影響不僅與N2H4質(zhì)量濃度有關(guān)，還與污泥形態(tài)有關(guān)。目前大部分研究集中于N2H4對(duì)顆粒形態(tài)AnAOB的影響，而低質(zhì)量濃度N2H4對(duì)生物膜形態(tài)厭氧氨氧化體系的研究尚有不足。但在城市污水低氨氮濃度條件下，厭氧氨氧化顆粒污泥粒徑小，難以有效持留在系統(tǒng)中，而通過(guò)載體形成的厭氧氨氧化生物膜可被有效截留于反應(yīng)器中，因此，生物膜形式的厭氧氨氧化技術(shù)具有更廣泛的應(yīng)用。懸浮載體上的生物膜可自發(fā)富集AnAOB，加速AnAOB的粘附與生長(zhǎng)，從而加速主流厭氧氨氧化工藝性能的提升。由于生物膜傳氧限制，厭氧氨氧化生物膜可以在低溶解氧(dissolvedoxygen，DO)環(huán)境下生長(zhǎng)，對(duì)正常的北方氣候溫度和低氨氮底物濃度適應(yīng)良好。因此，探究低質(zhì)量濃度N2H4對(duì)厭氧氨氧化生物膜的長(zhǎng)期影響，可以為厭氧氨氧化的在城市污水脫氮中的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。
1、材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)裝置
實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的小試采用3個(gè)圓柱形移動(dòng)床生物膜反應(yīng)器，有效容積為2L。R1為對(duì)照組，R2和R3中分別添加5mg·L-1和10mg·L-1的N2H4。3個(gè)反應(yīng)器中均填充已掛膜的填料，填充比為35%，填料直徑為25mm，高10mm。采用序批式活性污泥法(sequencingbatchreactoractivatedsludgeprocess，SBR)運(yùn)行，周期為6h(360min)，包括5min進(jìn)水，340min攪拌，14min沉降和1min排水，HRT為1d，日處理量為2L·d-1。3個(gè)反應(yīng)器均在常溫條件下運(yùn)行，溫度在(27.6±2.4)℃。反應(yīng)器裝置如圖1所示。
1.2 生物膜與模擬廢水
實(shí)驗(yàn)中用到的生物膜污泥來(lái)自實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定運(yùn)行196d的移動(dòng)床生物膜反應(yīng)器(movingbedbiofilmreactor，MBBR)，NLR為0.6kg·(m3·d)-1，生物膜系統(tǒng)中的污泥質(zhì)量濃度為(1800±100)mg·L-1。
實(shí)驗(yàn)采用模擬廢水，主要成分有50mg·L-1 NH4+-N、55mg·L-1 NO2--N、300mg·L-1 CaCl2·2H2O、180mg·L-1 MgSO4·7H2O、27.2mg·L-1 KH2PO4以及500mg·L-1 NaHCO3。每升廢水分別加入1mL微量元素Ⅰ和Ⅱ。N2H4以N2H4·H2SO4的形式投加。初始pH通過(guò)滴加1mol·L-1的HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)到6.9~7.3。配水采用自來(lái)水，未對(duì)其進(jìn)行脫氧處理，進(jìn)水DO質(zhì)量濃度為5mg·L-1。
1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
整個(gè)過(guò)程按不同運(yùn)行參數(shù)分為3階段。階段Ⅰ(1~11d)：為獲取較為穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)條件，反應(yīng)器在初始NLR下運(yùn)行。階段Ⅱ(12~46d)：加入N2H4運(yùn)行，3個(gè)反應(yīng)器N2H4質(zhì)量濃度分別為0、5、10mg·L-1。階段Ⅲ(47~60d)：停止加入N2H4，反應(yīng)器繼續(xù)運(yùn)行。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。
1.4 分析方法
用比色法測(cè)定NH4+-N、NO2--N、NO3--N和N2H4的質(zhì)量濃度。其中NH4+-N、NO2--N和NO3--N采用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法。通過(guò)加入1mol·L-1 HCl和0.1mol·L-1 KIO3溶液消除N2H4對(duì)NH4+-N測(cè)定的干擾。N2H4依照Watt和Chrisp的檢測(cè)方法，通過(guò)加入0.5%的氨基磺酸溶液消除NO2--N對(duì)N2H4測(cè)定的干擾。在每個(gè)階段結(jié)束(反應(yīng)器運(yùn)行第11、46和60天)留取生物樣品測(cè)定生物量(suspendedsolids，SS)、有機(jī)物量(volatilesuspendedsolids，VSS)、胞外聚合物(extracellularpolymericsubstances，EPS)、血紅素和微生物群落結(jié)構(gòu)。
采用水解法提取生物膜樣品中的EPS(主要由蛋白質(zhì)和多糖組成)，蛋白質(zhì)(proteins，PN)用改良Folin-Lowry法測(cè)定，使用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。多糖(polysaccharides，PS)用蒽酮-硫酸法測(cè)定，使用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。EPS濃度以單位質(zhì)量揮發(fā)性有機(jī)物中EPS的質(zhì)量(mg·g-1)表示。
用磷酸鹽緩沖液(PBS)通過(guò)細(xì)胞破碎的方式提取血紅素，以氯化血紅素作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過(guò)Pyridine-NaOH方法測(cè)定血紅素的含量。血紅素濃度以單位質(zhì)量揮發(fā)性有機(jī)物中血紅素的物質(zhì)的量(μmol·g-1)表示。
1.5 計(jì)算方法
為直觀表示出整個(gè)反應(yīng)體系中的主導(dǎo)反應(yīng)，依照亞硝化反應(yīng)(式(1))、硝化反應(yīng)(式(2))以及厭氧氨氧化反應(yīng)(式(3))的化學(xué)計(jì)量方程計(jì)算得到含有NH4+-N、NO2--N、NO3--N變化量的公式。在進(jìn)水無(wú)有機(jī)物的厭氧氨氧化反應(yīng)器中，異養(yǎng)生物對(duì)NRR的貢獻(xiàn)通常<5%，可忽略其對(duì)整體反應(yīng)的影響，故在計(jì)算時(shí)不考慮反硝化過(guò)程，計(jì)算得到式(4)~式(7)。
式中：θ為周期時(shí)間，d；C1，C2為1個(gè)周期內(nèi)NH4+-N和NO2--N的去除量，mg·L-1；C3為NO3--N的生成量，mg·L-1。Q1為AOB對(duì)NH4+-N的氧化速率(AOR)，g·(m3·d)-1；Q2為NOB對(duì)NO2--N的消耗速率(NOR)，g·(m3·d)-1。Q3 為AnAOB對(duì)NH4+-N的消耗速率(AnAOR)，g·(m3·d)-1；Q4為AnAOB對(duì)NO2--N的消耗速率(AnANR)，g·(m3·d)-1。
1.6 微生物群落結(jié)構(gòu)分析
在各階段的穩(wěn)定運(yùn)行期內(nèi)，保留生物膜樣品于-80℃條件下凍存。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)一進(jìn)行基因組DNA的提取，之后采用341F(5’-CCTACGGGNGGCWG-CAG-3’)和785R(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)作為擴(kuò)增引物，對(duì)細(xì)菌16SrRNA基因進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增。后續(xù)使用IlluminaNovaseq6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量并行測(cè)序，將相似水平在97%的序列歸為1個(gè)OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。
2、結(jié)果與討論
2.1 N2H4對(duì)總氮去除率的影響
反應(yīng)器各階段運(yùn)行性能如圖2所示。在進(jìn)水NH4+-N和NO2--N質(zhì)量濃度分別為(50.9±3.6)mg·L-1和(55.5±3.2)mg·L-1條件下持續(xù)運(yùn)行11d后，3個(gè)反應(yīng)器運(yùn)行趨于平穩(wěn)。階段Ⅰ結(jié)束時(shí)NRR分別為27.7、24.7、23.2g·(m3·d)-1，這一差異可能是由于實(shí)驗(yàn)前期選取的生物膜填料掛膜不均勻?qū)е隆?/span>
對(duì)照組R1內(nèi)逐漸形成穩(wěn)定的厭氧氨氧化環(huán)境，階段III時(shí)NRR最高達(dá)到139.2g·(m3·d)-1。R2和R3在加入N2H4后均表現(xiàn)出NRR先快速上升后下降的趨勢(shì)。階段Ⅱ運(yùn)行前期(第12~15天)，R2和R3中的NRR分別提升了74%和44%，此時(shí)N2H4的利用率均在74%以上。隨著運(yùn)行周期的增加(第16~46天)，R2和R3的脫氮效能逐漸下降，其中R2內(nèi)NRR下降了53%，R3內(nèi)NRR下降了64%，在階段Ⅱ結(jié)束時(shí)(第46天)R2和R3中N2H4的利用率分別從最高值(97%和79%)下降到32%。當(dāng)R2和R3系統(tǒng)內(nèi)的脫氮效能低于15g·(m3·d)-1時(shí)停止加N2H4，開(kāi)始階段Ⅲ的運(yùn)行。N2H4的抑制解除后，R2內(nèi)厭氧氨氧化活性開(kāi)始逐漸恢復(fù)，到階段Ⅲ末期，NRR由階段Ⅱ末期的11.0g·(m3·d)-1升至到33.4g·(m3·d)-1，R3的NRR也由10.4g·(m3·d)-1升至22.8g·(m3·d)-1，表明停止投加N2H4后，其抑制作用可緩慢恢復(fù)。經(jīng)14d恢復(fù)后，R2反應(yīng)器的脫氮效能恢復(fù)到投加N2H4前的水平，然而，10mg·L-1的N2H4對(duì)生物膜的抑制作用更強(qiáng)，生物膜恢復(fù)更加緩慢。SCHALK等(N2H4投加量為28.8mg·L-1)的研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。但GANESAN等(N2H4投加量為10mg·L-1)、ZHOU等(N2H4投加量為10mg·L-1)、MIODOŃSKI等 (N2H4投加量為3.7mg·L-1)和XIANG等(N2H4投加量為2~5mg·L-1)的研究結(jié)果均表明，投加不同質(zhì)量濃度的N2H4均能維持脫氮系統(tǒng)長(zhǎng)期運(yùn)行且N2H4可被快速消耗，這與本研究的結(jié)果并不一致。
本研究中出現(xiàn)N2H4濃度不斷積累且NRR不斷下降的現(xiàn)象，推測(cè)可能有以下2點(diǎn)原因。一方面，生物膜與顆粒污泥的形態(tài)結(jié)構(gòu)存在差異。對(duì)比本研究中使用的生物膜，顆粒污泥結(jié)構(gòu)更加密實(shí)，傳質(zhì)效率低，內(nèi)部更容易形成較強(qiáng)的濃度梯度，即實(shí)際進(jìn)入顆粒污泥內(nèi)部的N2H4濃度會(huì)低于水中測(cè)得的濃度。溶質(zhì)的濃度梯度是隨著生物膜厚度的增加而形成的，生物膜厚度會(huì)影響液體的流動(dòng)擴(kuò)散和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳質(zhì)效果，從而影響工藝整體性能。本研究中生物膜厚度較薄(約550μm)，可推測(cè)擴(kuò)散到生物膜內(nèi)部的N2H4質(zhì)量濃度較高，從而對(duì)AnAOB產(chǎn)生較強(qiáng)的毒性效應(yīng)。另一方面，基質(zhì)的質(zhì)量濃度和N2H4質(zhì)量濃度的比例不同。在前人研究N2H4對(duì)低基質(zhì)(TN＜100mg·L-1)厭氧氨氧化系統(tǒng)的長(zhǎng)期影響中，維持系統(tǒng)良好脫氮效果的基質(zhì)質(zhì)量濃度與N2H4質(zhì)量濃度的比例在10左右。本實(shí)驗(yàn)中R2和R3中此比例分別為21和10.5，但顯然R3受到更強(qiáng)的抑制作用，很可能是N2H4擴(kuò)散到生物膜的速度過(guò)快，因此，需要降低N2H4的質(zhì)量濃度以達(dá)到更好的TN去除效果。根據(jù)STROUS提出的厭氧氨氧化分解代謝模型，可推知未反應(yīng)完全的N2H4會(huì)促使反應(yīng)逆向進(jìn)行從而產(chǎn)生NH4+-N。SCHALK等在加入N2H4的厭氧氨氧化批式實(shí)驗(yàn)中觀察到，1mol的N2H4可被轉(zhuǎn)化為1.3mol的NH4+-N，在ZEKKER等的實(shí)驗(yàn)中，1mol的N2H4可形成1.63molNH4+-N。可見(jiàn)，AnAOB對(duì)N2H4有歧化作用，高質(zhì)量濃度的N2H4會(huì)導(dǎo)致NH4+-N不斷積累而升高，從而NRR也不斷下降。
2.2 N2H4對(duì)生物量的影響
整個(gè)運(yùn)行期間3個(gè)反應(yīng)器內(nèi)生物量變化如圖3所示。對(duì)照組R1中的生物量隨運(yùn)行時(shí)間的增加逐漸升高，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束時(shí)VSS達(dá)到1824mg·L-1。且R1在3個(gè)反應(yīng)器中表現(xiàn)出最好的脫氮性能，也證實(shí)了R1內(nèi)生物膜活性較高的結(jié)論。在階段Ⅱ中，R2和R3中均出現(xiàn)了污泥流失情況。停止加入N2H4后，2個(gè)反應(yīng)器內(nèi)污泥量仍持續(xù)下降。R2在階段Ⅱ和階段Ⅲ結(jié)束時(shí)的VSS分別為1019mg·L-1和880mg·L-1，R3在階段Ⅱ和階段Ⅲ內(nèi)VSS分別為1213mg·L-1和587mg·L-1。對(duì)比初始值，階段Ⅲ結(jié)束時(shí)R2的VSS濃度下降了52%，R3內(nèi)的VSS濃度下降了55%，可以看出，加入N2H4后反應(yīng)器內(nèi)部生物膜會(huì)逐漸脫落和流失，生物膜活性減弱，導(dǎo)致系統(tǒng)內(nèi)部的脫氮效能下降。
2.3 N2H4對(duì)各反應(yīng)過(guò)程的影響
由于進(jìn)水中含有一定溶解氧，促進(jìn)了脫氮系統(tǒng)中硝化菌的生長(zhǎng)。為評(píng)估系統(tǒng)中亞硝化，硝化和厭氧氨氧化效果，對(duì)反應(yīng)器中各階段的氮素變化量進(jìn)行分析，從而得到各個(gè)反應(yīng)體系中氨氧化菌(ammonia-oxidizingbacteria，AOB)、亞硝酸鹽氧化菌(nitrite-oxidizingbacteria，NOB)和AnAOB的變化趨勢(shì)，結(jié)果如圖4所示。從圖4(a)可以看出，在階段Ⅰ和階段Ⅱ，R1中的AOB和NOB均維持在穩(wěn)定狀態(tài)，AnAOB活性逐漸升高，階段Ⅱ結(jié)束時(shí)提高了約80%。但在階段Ⅲ開(kāi)始時(shí)AOB作用減弱，NOB和AnAOB作用增強(qiáng)，NRR最高可達(dá)139.2g·(m3·d)-1。R2以及R3內(nèi)基質(zhì)消耗速率分別見(jiàn)圖4(b)和圖4(c)。加入N2H4后2個(gè)反應(yīng)器內(nèi)AOR、AnAOR和AnANR短暫提升，與NRR變化規(guī)律相一致，說(shuō)明N2H4的投加會(huì)在短期內(nèi)迅速提高厭氧氨氧化生物膜系統(tǒng)的脫氮效能。有研究表明，外源N2H4可以直接被AnAOB利用，促進(jìn)厭氧氨氧化進(jìn)程。對(duì)本研究中的厭氧氨氧化生物膜來(lái)說(shuō)，N2H4添加量為5mg·L-1時(shí)的脫氮效果優(yōu)于10mg·L-1。對(duì)比對(duì)照組R1，R2和R3系統(tǒng)內(nèi)的AnAOB和AOB的活性均只在加入N2H4的前4d得到提升，但很快就下降到較低水平，與NRR的變化規(guī)律一致。這可能是由于N2H4的長(zhǎng)期抑制作用導(dǎo)致反應(yīng)器內(nèi)生物量隨著生物膜不斷脫落而流失(SS分別為6194mg·L-1和4322mg·L-1)，因此，反應(yīng)器內(nèi)功能菌的數(shù)量進(jìn)一步降低。階段Ⅱ運(yùn)行后期(第31~46天)R2和R3出水N2H4質(zhì)量濃度分別穩(wěn)定在1~3mg·L-1和3~5mg·L-1，推測(cè)在此階段N2H4的投加量超過(guò)AnAOB的利用量，AnAOB不能有效降解N2H4，繼續(xù)添加會(huì)導(dǎo)致N2H4逐漸積累從而抑制AnAOB的活性。由于N2H4對(duì)AOB和NOB均有毒性作用，因此，整個(gè)體系中AOB和NOB作用均較弱，而NOB比AOB更敏感，會(huì)導(dǎo)致NOB的占比更低。在階段Ⅲ中，停止加入N2H4后，R2和R3中AOB和AnAOB的占比逐漸上升，體系中的脫氮效果也在緩慢提升，可見(jiàn)N2H4的抑制效果是可逆的，但N2H4為5mg·L-1的R2能逐漸恢復(fù)到抑制前的脫氮水平，而投加10mg·L-1 N2H4的R3較難恢復(fù)。
2.4 N2H4對(duì)EPS的影響
EPS對(duì)生物膜的形成和穩(wěn)定有重要作用，因此，有必要探討N2H4對(duì)生物膜EPS的影響。3個(gè)反應(yīng)器中EPS變化量及蛋白質(zhì)和多糖的比值(PN/PS)變化情況如圖5所示。對(duì)照組R1的EPS處于穩(wěn)定增長(zhǎng)狀態(tài)，各階段EPS含量分別為6.76、10.03和11.22mg·g-1，PN/PS穩(wěn)定在2.19~2.59，與反應(yīng)器中NRR的變化趨勢(shì)一致。階段Ⅱ結(jié)束時(shí)(第46天)，R2中EPS由階段I的6.60mg·g-1增加到17.68mg·g-1，同時(shí)PN和PS的含量也發(fā)生變化，PN/PS由3.49增加到8.23。由于外部環(huán)境的改變會(huì)刺激細(xì)菌分泌較多的EPS，這種自我保護(hù)行為會(huì)適當(dāng)減輕不良環(huán)境造成的影響，N2H4的毒性作用導(dǎo)致R2內(nèi)的細(xì)菌分泌大量EPS。EPS中的PN/PS通常用于定義生物膜的狀態(tài)，活性污泥的PN/PS維持在1~4是一個(gè)適宜的水平。由于PN會(huì)比PS優(yōu)先響應(yīng)外部環(huán)境變化，且較高質(zhì)量濃度N2H4可通過(guò)分泌大量結(jié)合蛋白(boundprotein，B-PN)觸發(fā)厭氧氨氧化污泥的自我保護(hù)機(jī)制，導(dǎo)致R2中的PN增長(zhǎng)了2倍，生物膜變得蓬松不穩(wěn)定，促進(jìn)了生物膜的脫落和流失，引起反應(yīng)器運(yùn)行效能的下降。這與階段Ⅱ觀察到的反應(yīng)器出水濁度增大以及NRR的下降一致。與R2相反，R3內(nèi)的EPS由9.23mg·g-1下降到4.38mg·g-1，PN/PS的值由2.33增加到6.88。這可能是由于R3中N2H4質(zhì)量濃度過(guò)高，對(duì)生物膜產(chǎn)生更強(qiáng)的毒性致使微生物死亡，導(dǎo)致EPS含量下降。停止加入N2H4后，R2的EPS含量下降了42%，PN/PS為2.20，與對(duì)照組R1近乎相平。R3的EPS含量逐漸升高至8.84mg·g-1，PN/PS為2.25。PN/PS的值越低則系統(tǒng)穩(wěn)定性越高，2個(gè)反應(yīng)器內(nèi)PN/PS均降到適宜范圍(1~4)內(nèi)，可證明污泥結(jié)構(gòu)已經(jīng)趨于穩(wěn)定，受N2H4刺激后生物膜緩慢恢復(fù)。
2.5 N2H4對(duì)血紅素的影響
血紅素參與AnAOB的主要代謝反應(yīng)，具有催化和電子轉(zhuǎn)移潛力，可以作為評(píng)估厭氧氨氧化性能的指標(biāo)。不同質(zhì)量濃度N2H4對(duì)AnAOB中血紅素的影響如圖6所示。對(duì)照組R1各階段的血紅素含量分別為0.73、0.81、0.72μmol·g-1，整體維持在平穩(wěn)狀態(tài)。R2和R3中血紅素含量均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。R2從0.45μmol·g-1 降至0.39μmol·g-1，R3則從0.78μmol·g-1降至0.11μmol·g-1。在厭氧氨氧化的代謝過(guò)程中，N2H4作為厭氧氨氧化過(guò)程的中間產(chǎn)物，會(huì)被脫氫酶(hydrazinedehydrogenase，HDH)氧化成N2，從而完成脫氮過(guò)程。細(xì)胞色素c的含量與HDH活性存在正相關(guān)，HDH酶的活性越高，處于還原狀態(tài)的細(xì)胞色素c的就越多，而血紅素是細(xì)胞色素c的關(guān)鍵組分。在本研究中，加入N2H4后的生物膜中的血紅素含量一直下降，即HDH的活性一直下降，阻礙了厭氧氨氧化過(guò)程中催化N2H4氧化生成N2這一反應(yīng)的正向進(jìn)行，從而導(dǎo)致N2H4積累。由于N2H4具有強(qiáng)毒性，HDH受到高質(zhì)量濃度N2H4的抑制，血紅素的還原能力下降，AnAOB的活性受抑制，最終導(dǎo)致系統(tǒng)中NRR下降。此外，通過(guò)對(duì)比R2和R3在整個(gè)反應(yīng)階段血紅素的變化量，可看出N2H4的加入量越高，抑制作用越明顯，厭氧氨氧化活性越難以恢復(fù)。
2.6 N2H4對(duì)微生物群落的影響
反應(yīng)器在不同運(yùn)行周期門(mén)水平和屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)如圖7所示�？梢钥闯�，細(xì)菌的相對(duì)豐度隨運(yùn)行條件的改變有明顯差異，表明N2H4對(duì)微生物群落的影響逐漸顯現(xiàn)。由圖7(a)中可觀察到所有樣本中的主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)有變形菌門(mén)(Proteobacteria)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)和裝甲菌門(mén)(Armatimonadetes)，這些都是脫氮系統(tǒng)中常見(jiàn)的典型細(xì)菌。有研究表明AnAOB隸屬于浮霉菌門(mén)，對(duì)照組R1在整個(gè)運(yùn)行周期內(nèi)Planctomycetes一直維持在較高水平(12.86%~23.36%)，實(shí)現(xiàn)了MBBR脫氮系統(tǒng)的長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行。加入N2H4后，R2中Planctomycetes呈現(xiàn)先上升至26.33%，而后下降至2.50%的現(xiàn)象，豐度的上升與NRR的短暫增加的結(jié)果相一致。R3內(nèi)幾乎不存在Planctomycetes，其相對(duì)豐度從4.44%下降到2.86%，同時(shí)可觀察到放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)和酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)占明顯優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)豐度分別由0.55%和0.31%增長(zhǎng)至7.17%和10.46%，說(shuō)明N2H4會(huì)促進(jìn)其它菌門(mén)的生長(zhǎng)，Planctomycetes與Actinobacteria等菌門(mén)之間對(duì)底物的競(jìng)爭(zhēng)增大，降低了AnAOB的占比，破壞脫氮系統(tǒng)的穩(wěn)定性。
圖7(b)反映了了各反應(yīng)器在不同運(yùn)行階段，相對(duì)豐度占比在前15的主要菌屬。樣品中均檢測(cè)出2種屬水平AnAOB，Candidatus_Kuenenia和Candidatus_Brocadia，其中以Candidatus_Kuenenia為主。對(duì)照組R1在整個(gè)運(yùn)行周期內(nèi)Candidatus_Kuenenia一直維持在較高水平(11.18%~22.37%)，即使在階段Ⅱ略有下降但仍占主導(dǎo)地位。對(duì)比階段Ⅲ和階段Ⅰ，R2和R3中Candidatus_Kuenenia所占比例分別下降了64%和61%，表明長(zhǎng)期添加微量N2H4會(huì)使AnAOB相對(duì)豐度降低，這與反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程中系統(tǒng)脫氮效率降低的現(xiàn)象一致。Fimbriimonadales在對(duì)照組R1中的相對(duì)豐度較高，為13.18%~22.68%。有研究表明，Fimbriimonadales是一種異養(yǎng)菌，也可以利用NH4+-N和NO2--N生成N2。本研究中Fimbriimonadales可能與AnAOB共存于反應(yīng)器中協(xié)同脫氮。對(duì)照組R1中Burkholderiaceae一直維持在4.89%~6.37%，R3中Burkholderiaceae的相對(duì)豐度從階段Ⅰ的5.16%上升到階段Ⅱ的11.17%。Burkholderiaceae屬于反硝化細(xì)菌，具有還原NO3--N或NO2--N的能力�？梢�(jiàn)，N2H4的長(zhǎng)期加入促進(jìn)了Burkholderiaceae的生長(zhǎng)，加大了對(duì)底物NO2--N的競(jìng)爭(zhēng)，抑制了AnAOB生長(zhǎng)。有研究表明，Limnobacter可與AnAOB共生，這可以保護(hù)AnAOB免受不利環(huán)境的影響。對(duì)照組中Limnobacter的豐度穩(wěn)定在7%左右，但該菌屬在R2中的豐度由9.55%降至2.12%，R3中由5.64%降至1.62%。N2H4會(huì)破環(huán)這種保護(hù)平衡，令AnAOB暴露在不利環(huán)境中，從而降低其活性。終上所述，N2H4不僅直接降低Candidatus_Kuenenia的豐度，還對(duì)與AnAOB菌屬協(xié)同脫氮的其它菌屬起到抑制作用，從而降低反應(yīng)器整體功能菌屬的活性，進(jìn)而影響脫氮效果。
3、結(jié)論
1)在進(jìn)水NH4+-N質(zhì)量濃度在(50.9±3.6)mg·L-1，NO2--N質(zhì)量濃度在(55.5±3.2)mg·L-1的條件下，加入5mg·L-1和10mg·L-1的N2H4可以使NRR短暫增長(zhǎng)，但長(zhǎng)期運(yùn)行后NRR分別下降了53%和64%。N2H4的長(zhǎng)期加入會(huì)對(duì)生物膜產(chǎn)生生物毒性，抑制脫氮過(guò)程。
2)5mg·L-1的N2H4使生物膜的EPS分泌量提高，觸發(fā)生物膜保護(hù)機(jī)制，解除N2H4抑制后，EPS濃度恢復(fù)，但生物膜變得松散，易脫落，導(dǎo)致污泥流失。10mg·L-1的N2H4抑制了生物膜中AnAOB的活性，EPS和血紅素含量均明顯下降，解除N2H4抑制后，生物膜脫氮活性也難以恢復(fù)。
3)長(zhǎng)期添加微量N2H4會(huì)降低厭氧氨氧化生物膜脫氮系統(tǒng)中Planctomycetes和Candidatus_Kuenenia的豐度。（來(lái)源：北京工商大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，唐山曹妃甸城市排水有限公司，浦華控股有限公司）
