近年來(lái)，隨著國(guó)家及地方城市污水處理廠對(duì)氮、磷排放標(biāo)準(zhǔn)的不斷提高，新一輪提升改造也正同步開(kāi)展。移動(dòng)床生物膜反應(yīng)器（MBBR）因無(wú)需增加額外占地和改變?cè)泄に嚶肪�便能實(shí)現(xiàn)深度脫氮除磷而受到廣泛關(guān)注。另外，該工藝可大幅減少改造工程量，具有運(yùn)行費(fèi)用低、管理簡(jiǎn)便、處理效果穩(wěn)定等特點(diǎn)，可較好地解決市政污水處理廠提升改造中的難題。
MBBR具備深度脫氮除磷功能與其兼具活性污泥和生物膜兩種微生物存在形式有著密切關(guān)系。為此，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)MBBR中的微生物結(jié)構(gòu)及功能展開(kāi)了研究。張晶晶等對(duì)比分析了MBBR填料生物膜與活性污泥的微生物群落，結(jié)果表明好氧和缺氧區(qū)填料生物膜的微生物豐度均比活性污泥高，其中好氧區(qū)富集了較多的硝化菌，而缺氧區(qū)生物膜上的微生物主要以反硝化菌為主；吳迪等分析了山西某污水廠MBBR提標(biāo)改造前后的菌種變化，結(jié)果表明懸浮填料對(duì)硝化菌群富集具有重要作用，填料對(duì)硝化的貢獻(xiàn)率高達(dá)79%，懸浮載體上存在的反硝化菌群為同步硝化反硝化提供了微觀保障，加入懸浮填料后優(yōu)化了系統(tǒng)的菌落分布，增加了菌群的多樣性；盧欣欣等采用MBBR實(shí)現(xiàn)了一體式短程硝化-厭氧氨氧化的耦合，得出MBBR中活性污泥主要完成亞硝化、生物膜主要完成厭氧氨氧化的結(jié)論。但是，目前大多數(shù)研究?jī)H分析填料生物膜的整體微生物結(jié)構(gòu)，對(duì)生物膜不同厚度的生物群落研究較少，無(wú)法深入分析污染物去除機(jī)理。
鑒于此，筆者對(duì)某污水處理廠經(jīng)MBBR改造后的填料生物膜進(jìn)行更細(xì)微的分類(lèi)，將填料上的微生物分成表面松散型和內(nèi)部緊密型生物膜，并對(duì)比緊密型生物膜、松散型生物膜和活性污泥的菌群結(jié)構(gòu)與物種特性，進(jìn)一步探索不同功能菌群的分布及功能，以期為MBBR技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供微觀理論支撐。
1、材料與方法
1.1 改造方案
該污水廠處理規(guī)模為4×104m3/d，改造前生化段主體工藝為SBR的變形工藝——MSBR（改良式序列間歇反應(yīng)器），出水水質(zhì)執(zhí)行《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB18918—2002）一級(jí)B要求。為進(jìn)一步提高出水水質(zhì)，達(dá)到地表準(zhǔn)Ⅳ類(lèi)水質(zhì)要求，提出以下改造方案：向MSBR池的主曝氣區(qū)投加一定數(shù)量的懸浮填料，以提高反應(yīng)器中的微生物種類(lèi)和優(yōu)勢(shì)種群數(shù)量，從而提高反應(yīng)器的處理效率。即由MSBR改造為MBBR，于2017年改造完成。
1.2 懸浮填料特性
懸浮填料為思普潤(rùn)公司生產(chǎn)的SPR-2型懸浮填料，其材質(zhì)為高密度聚乙烯（HDPE），標(biāo)稱(chēng)直徑為（25±0.5）mm；標(biāo)稱(chēng)高度為（10±1）mm；密度約為0.94~0.97g/cm³，有效比表面積≥620m2/m3，填料壽命>15年，抗壓強(qiáng)度>50N/mm2，紫外損失值<0.06%。懸浮填料為流化填料，正常運(yùn)行時(shí)懸浮于水中，能使微生物膜有效附著生長(zhǎng)以確保運(yùn)行效果，且其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間浸泡于水中不會(huì)分解，亦不會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生毒害作用，另外，其無(wú)需任何支架或其他的固定方式，可自由地分布在池體內(nèi)。SPR型懸浮填料采用蜂窩狀內(nèi)部結(jié)構(gòu)、圓筒狀外形等獨(dú)特的設(shè)計(jì)，在保證高空隙率的情況下提高填料比表面積，增加了反應(yīng)器的生物量，同時(shí)可有效改善污水在填料間的流動(dòng)流態(tài)，增強(qiáng)水流紊流程度，減少污水通過(guò)填料的阻力。填料的材質(zhì)和結(jié)構(gòu)使得其具備以下特點(diǎn)：水力特性好，效率高，占地�。荒芎牡�；易于安裝和維護(hù)，設(shè)計(jì)靈活；無(wú)生物膜堵塞，易于流化；使用壽命長(zhǎng)。改造前經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，投加填料10d后，生物膜鏡檢可發(fā)現(xiàn)多種微生物，填料掛膜、生物膜馴化成功。
1.3 微生物分析
1.3.1 樣品獲取及處理
2021年9月，于某污水廠生化池內(nèi)取懸浮填料（運(yùn)行近4年）及活性污泥用于微生物檢測(cè)，活性污泥即反應(yīng)池內(nèi)的懸浮污泥。取樣時(shí)水溫為30.0℃、pH為7.09。為區(qū)分緊密型生物膜和松散型生物膜，進(jìn)行以下預(yù)處理：將取出的懸浮填料立刻置于1000mL燒杯，倒入純水浸沒(méi)填料，手動(dòng)振蕩淘洗5min后取出填料，燒杯內(nèi)的污泥即為松散型生物膜；經(jīng)淘洗后，將填料撈出沖洗，仍存留在填料上的生物附著較為緊密，用牙簽和小刀將附著在填料上的污泥刮出，刮出的污泥即為緊密型生物膜。
將收集到的活性污泥、緊密型生物膜和松散型生物膜樣品置于離心機(jī)中以5000r/min的速度離心5min，去除上清液后加入去離子水再次離心，重復(fù)兩次，保留底部污泥樣品；再用冷凍干燥機(jī)對(duì)離心后的樣品冷凍干燥。
1.3.2 DNA的提取及PCR擴(kuò)增
采用E.Z.N.ATMMag-BindSoilDNAKit（M5635-02，OMEGA，USA）提取污泥樣本的基因組DNA。并對(duì)細(xì)菌16SrDNA的V4和V5區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為515F（GTGYCAGCMGCCGCGG TAA）和806R（GGACTACNVGGGTWTCTAAT）。PCR擴(kuò)增在由15μL的2×PhusionMasterMix、1.5μL引物（2μmol/L）、10μL模板DNA（1ng/μL）以及2μL的超純水混合而成的30μL混合液中進(jìn)行。將混合液置于95℃下擴(kuò)增3min，而后繼續(xù)95℃下擴(kuò)增30s（擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)），然后在55℃下擴(kuò)增30s，以及72℃下擴(kuò)增45s，最后72℃下再擴(kuò)增5min。
1.3.3 測(cè)序及數(shù)據(jù)分析
從2%的瓊脂糖凝膠中用GeneJETGel試劑盒（ThermoScientific）提取出擴(kuò)增子，并用Nano Drop2000熒光光譜儀（ThermoScientific）進(jìn)行量化。隨后，每個(gè)樣品中提純出的擴(kuò)增子，在IlluminaMiSeq平臺(tái)上按標(biāo)準(zhǔn)方法配對(duì)并測(cè)序。數(shù)據(jù)分析采用IlluminaMiSeqPE300平臺(tái)，在免費(fèi)在線I-Sanger平臺(tái)上進(jìn)行分析。
1.4 分析測(cè)試方法
COD、NH3-N、TN、TP等采用標(biāo)準(zhǔn)分析方法測(cè)定；利用體式顯微鏡觀察填料上的微生物特性。
2、結(jié)果與討論
2.1改造前后污染物去除效果對(duì)比
MBBR改造前后的進(jìn)出水水質(zhì)變化如圖1所示�？梢钥闯觯脑烨昂筮M(jìn)水COD濃度波動(dòng)較大，但出水濃度始終維持在20mg/L以?xún)?nèi)，表明MSBR和MBBR對(duì)COD均有較好的去除效果。另外，改造前后出水NH3-N濃度均維持在0.3mg/L左右，無(wú)明顯變化。但值得注意的是，MBBR對(duì)TN和TP的去除有明顯的強(qiáng)化作用，其中TN平均去除率從改造前的43.0%提高至改造后的60.3%，出水TP也由改造前的0.35mg/L降至改造后的0.13mg/L，去除率由77.7%提高至91.2%。由此可知，經(jīng)MBBR改造后，對(duì)COD和NH3-N的去除沒(méi)有較大影響，但對(duì)TN和TP的去除有明顯的強(qiáng)化作用，去除率分別提高了17.3%和13.5%，這可能與投加懸浮填料形成的泥膜混合系統(tǒng)有關(guān)，生物膜與活性污泥不同的污泥停留時(shí)間使得世代周期較長(zhǎng)的反硝化菌能在生物膜上得到有效富集，強(qiáng)化對(duì)TN的去除；而世代周期較短的聚磷菌富集于活性污泥中，通過(guò)排放剩余污泥達(dá)到去除TP的效果。另外，投加填料后的出水水質(zhì)較為穩(wěn)定，這表明改造后工藝的抗沖擊能力得到了增強(qiáng)。
2.2 微生物種群分析
懸浮填料的加入一定程度上強(qiáng)化了生化段的處理效能，這與其附著的微生物分布及種類(lèi)密切相關(guān)。對(duì)此，本研究根據(jù)微生物的分布情況進(jìn)行取樣：①填料外微生物，即活性污泥；②填料表層生物膜，即松散型生物膜；③填料內(nèi)層生物膜，即緊密型生物膜。而后，對(duì)以上3個(gè)樣品進(jìn)行了高通量測(cè)序分析。污泥樣品的多樣性指數(shù)見(jiàn)表1。
由表1可知，緊密型生物膜、松散型生物膜和活性污泥樣品的有效序列數(shù)分別為43854、41531和36986，覆蓋率均超過(guò)99%，即表明所收集到的基因序列能夠很好地代表微生物群落。微生物多樣性用Shannon和Simpson指數(shù)表征，Shannon指數(shù)越大、Simpson指數(shù)越小，則說(shuō)明物種越豐富。從表1可以看出，相比活性污泥，填料上的緊密型和松散型生物膜物種豐度更低。此外，基于OTUs水平的維恩圖顯示（見(jiàn)圖2），3種類(lèi)型污泥樣品共有的OTUs為1016個(gè)，具有較高的相似度。但與此同時(shí)，緊密型和松散型生物膜相比活性污泥獨(dú)有的OTUs數(shù)量相對(duì)較多，表明填料上的微生物群落更具有特異性，這可能是因?yàn)樘盍辖Y(jié)構(gòu)使得緊密型和松散型生物膜富集了特定功能的菌種。
從微生物在門(mén)水平上的分析結(jié)果（如圖3所示）來(lái)看，3個(gè)樣品中豐度最高的門(mén)為Proteobacteria、Chloroflexi和Actinobacteriota，而這三者也是城市污水處理過(guò)程中最常出現(xiàn)的微生物門(mén)類(lèi)。相比之下，Nitrospirota和Dadabacteria的豐度出現(xiàn)了較大差異。Nitrospirota在緊密型生物膜中的豐度為10.5%，而在松散型生物膜和活性污泥中的豐度僅為2.7%和1.3%。此外，Dadabacteria同樣在緊密型生物膜中富集，豐度達(dá)到了2.4%，而在松散型生物膜和活性污泥中的豐度僅為0.9%和0.1%。不同的是，Patescibacteria在活性污泥和松散型生物膜中的豐度（3.6%和2.9%）高于緊密型生物膜中的豐度（1.1%）。
從微生物在屬水平上的分析結(jié)果（見(jiàn)圖4）來(lái)看，活性污泥、松散型生物膜和緊密型生物膜的優(yōu)勢(shì)菌屬存在明顯差異。其中，活性污泥富集了大量硝化菌和除磷菌，包括966-1（3.56%）、norank_f__Saprospiraceae（1.1%）和norank_f__NS9_marine_group（1.34%）等硝化菌，這與活性污泥具有更高的氧含量有關(guān)；另外，除磷菌也在活性污泥中實(shí)現(xiàn)富集，如norank_f__norank_o__Saccharimonadales（1.76%）可以產(chǎn)磷酸酶，有利于磷酸的礦化，norank_f__Gemmatimonadaceae（1.52%）可以增強(qiáng)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)，這可能是因?yàn)榛钚晕勰嘞啾壬锬ぞ哂休^短的污泥停留時(shí)間，因此更能夠?qū)崿F(xiàn)除磷菌的富集。
值得注意的是，松散型生物膜上存在著豐度較高的與抗生素耐性基因、耐金屬、有毒污染物和木質(zhì)素降解等相關(guān)的功能菌屬。例如，norank_f__JG30-KF-CM45具有降解抗生素耐性基因及反硝化作用，在松散型生物膜上的豐度達(dá)到5.26%，魏健等采用臭氧催化氧化-曝氣生物濾池（BAF）組合工藝對(duì)抗生素廢水二級(jí)生化處理出水進(jìn)行深度處理，證明了norank_f__JG30-KF-CM45是降解抗生素類(lèi)污染物的主要菌屬。另外，與金屬耐受性相關(guān)的菌屬在松散型生物膜上也實(shí)現(xiàn)了有效富集，包括norank_f__norank_o__norank_c__KD4-96（4.28%）和norank_f__norank_o__Microtrichales（2.19%）等，Zou等的研究中，norank_f__norank_o__norank_c__KD4-96屬的相對(duì)豐度與Cu、Ni和Se含量呈正相關(guān)，表明這些金屬可能對(duì)該屬的生長(zhǎng)繁殖有促進(jìn)作用；Girardot等人報(bào)道norank_f__norank_o__norank_c__KD4-96屬在金屬污染的荒地中占據(jù)主導(dǎo)地位；Zeng等人在位于化學(xué)工業(yè)區(qū)的含有重金屬的廢水處理廠微生物群落的特征研究中證明了norank_f__norank_o__Microtrichales具有耐Mn、Ni、Cd和Zn的潛力；除此以外，norank_f__67-14（2.54%）對(duì)有毒污染物降解活性很強(qiáng)，norank_f__norank_o__SBR1031（1.24%）可降解芳香化合物，unclassified_f__Solirubrobacteraceae（2.39%）具有木質(zhì)素降解能力。這些菌種在松散型生物膜中大量富集，說(shuō)明松散型生物膜對(duì)有毒有害物質(zhì)、金屬和抗生素有很好的降解或吸附能力，對(duì)緊密型生物膜起到保護(hù)作用。絲狀菌Candidatus_Alysiosphaera（1.13%）在松散型生物膜中也被富集，絲狀菌可以起到骨架作用，使生物膜結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。耐抗生素、抗金屬、降解有毒污染物等微生物的功能在之前的研究中都已得到證明，在本次研究的污水廠中，進(jìn)水含有大量工業(yè)廢水，與之前研究的條件相一致，進(jìn)一步證明了松散型生物膜在污水處理過(guò)程中具有耐抗生素、抗金屬等特殊作用。
緊密型生物膜上主要富集有反硝化菌、纖維素水解菌和厭氧氨氧化菌等，除此之外，還存在一部分硝化菌。norank_f__Caldilineaceae（8.43%）可以在厭氧條件下促進(jìn)木質(zhì)纖維素和半纖維素的分解，其富集可能與該污水處理廠的進(jìn)水含有造紙廢水有關(guān)，此外，該菌屬具有反硝化作用。同樣具有反硝化作用的還有norank_f__norank_o__Dadabacteriales（2.39%）、norank_f__Blastocatellaceae（1.25%）和unclassified_f__Hyphomicrobiaceae（1.67%），這些菌屬均被報(bào)道與反硝化有關(guān)，說(shuō)明反硝化作用主要發(fā)生在生物膜內(nèi)部緊密層，這些都與填料生物膜形成的分層結(jié)構(gòu)和生物膜較長(zhǎng)的污泥停留時(shí)間有關(guān)。厭氧氨氧化菌norank_f__Microtrichaceae（2.21%）也在緊密型生物膜中得到富集，該菌屬可利用NO2--N來(lái)氧化NH3-N，從而減少碳源的消耗。有趣的是，Nitrospira在緊密型生物膜中的豐度為10.47%，這可能是因?yàn)?/span>Nitrospira作為硝化菌，可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，在氨氮濃度較低環(huán)境中更具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。此外，檢測(cè)到的Pedomicrobium（3.32%）和Hyphomicrobium（2.35%）都屬于鐵、錳氧化微生物，Hyphomicrobium還被報(bào)道是一種兼性自養(yǎng)反硝化菌。另外，產(chǎn)EPS的SWB02（1.35%）也在緊密型生物膜中富集，對(duì)生物膜的形成和穩(wěn)定起到了重要作用。
活性污泥、松散型生物膜和緊密型生物膜的優(yōu)勢(shì)菌種及功能總結(jié)如表2所示。
泥膜系統(tǒng)菌屬之間可能的協(xié)作如圖5所示�？傮w而言，填料的加入不僅為微生物的生長(zhǎng)提供了一個(gè)良好載體，同時(shí)也改變了MBBR泥膜系統(tǒng)的菌落分布，活性污泥及填料上不同厚度生物膜的優(yōu)勢(shì)菌屬存在明顯區(qū)別。生物膜緊密層主要是降解纖維素和反硝化，此外還有厭氧氨氧化和硝化作用發(fā)生；松散層起到抗金屬和耐抗生素以及難降解污染物的降解作用，另外起到保護(hù)緊密層的作用；活性污泥主要起硝化和除磷的作用。本研究表明，生物膜需要一定的厚度，厚度越厚越有利于對(duì)氮和磷的去除，其抗沖擊能力也更強(qiáng)，松散型生物膜也更能起到抗擊毒害和保護(hù)緊密型生物膜的作用。
3、結(jié)論
①在30℃水溫下，活性污泥、松散型生物膜和緊密型生物膜的優(yōu)勢(shì)菌屬存在明顯區(qū)別。活性污泥富集了大量硝化菌和除磷菌；松散型生物膜上存在著豐度較高的與耐抗生素、耐金屬和降解有毒污染物等相關(guān)的功能菌屬；緊密型生物膜上主要富集兼具反硝化和纖維素水解的菌屬，以及厭氧氨氧化菌等。但對(duì)于低溫下泥膜系統(tǒng)內(nèi)不同厚度生物膜與活性污泥的微生物群落有待進(jìn)一步研究。
②活性污泥的氧含量較高且泥齡較短，有利于硝化菌和除磷菌的富集，主要承擔(dān)硝化和除磷的作用；松散型生物膜位于填料外層，起到攔截過(guò)濾污染物、保護(hù)內(nèi)層生物膜的作用；緊密型生物膜的泥齡較長(zhǎng)，有利于反硝化菌的生長(zhǎng)，主要進(jìn)行反硝化反應(yīng)和纖維素水解。泥膜系統(tǒng)內(nèi)不同厚度的生物膜與活性污泥之間相互協(xié)作，實(shí)現(xiàn)了對(duì)氮和磷的強(qiáng)化去除。（來(lái)源：浙江工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，浙江富春紫光環(huán)保股份有限公司）
