1 引言(Introduction)
TCP是有機廢水中一種最常見的氯酚類物質(zhì)，主要來源于造紙、印染、紡織等行業(yè)廢水.由于TCP的水溶解性較大，且土壤等固體物質(zhì)對其吸附和固定作用較弱，常以水為載體廣泛存在. TCP結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，難以降解，且具有三致性，美國環(huán)�？偩忠褜⑵淞袨榱恕皟�(yōu)先污染物”. 利用真菌、青霉菌、曲霉菌和酵母菌等生物法處理酚類廢水，工藝簡單，效果好. Lentinula對橄欖油排放廢水中酚類(苯酚等)有毒物質(zhì)具有較好的去除效果.曲霉菌可以p-甲酚和4-甲基苯酚作為唯一碳源，但對氯酚類效果不大.Kiyohara等發(fā)現(xiàn)釀造酵母、鞘脂菌可降解TCP.Aguayo等發(fā)現(xiàn)鉤蟲貪銅菌、鞘氨醇單胞菌、光合細菌等也能降解TCP.這些研究為酚類物質(zhì)的生物處理打下了一定基礎(chǔ)，但國內(nèi)外大多數(shù)研究主要局限于細菌對TCP降解. 相比細菌，真菌具有較強的抗毒性和環(huán)境適應(yīng)能力，在處理氯酚廢水方面較細菌更具優(yōu)勢. 鐮刀菌為一種真菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，適應(yīng)性強. 鐮刀菌具有良好的降解苯酚、4-CP的能力，但對毒性更強TCP的降解情況還未知. 本文研究了鐮刀菌降解TCP的降解影響因素及其效果，并探討了其降解動力學(xué)與降解機制.
2 材料與方法(Materials and methods) 2.1 菌種與培養(yǎng)基
菌種：從膨潤土中分離得到的一種鐮刀菌，確定為層出鐮刀菌Fusarium proliferatum，屬于鐮刀菌屬.培養(yǎng)溫度30 ℃.
固體培養(yǎng)基：KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂15~20 g，蒸餾水500 mL. 滅菌后加入相應(yīng)濃度的TCP搖勻，在無菌操作臺上倒平板，待平板冷卻凝固后進行接種，最后于30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng).
液體培養(yǎng)基：CaCl2 0.1 g，KH2PO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，H2O 1000 mL，微量元素(FeSO4·7H2O 3.82 g，CoCl2·6H2O 0.25 g，H3BO3 6 mg，CuSO4·5H2O 2.9 mg等)1 mL. 所有培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌30 min.
孢子懸濁液：在馴化好且長有豐富的白色分生孢子的蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中刮取部分孢子置于無機鹽固體培養(yǎng)基(含100 mg·L-1 TCP)上，30 ℃恒溫培養(yǎng). 7 d后轉(zhuǎn)接于150 mg·L-1 TCP的無機鹽固體培養(yǎng)基馴化3次，待菌體大量長出后于無菌條件下刮取孢子至無菌蒸餾水中，振蕩分散成乳白色的孢子懸液，光密度約為0.1(OD400)，孢子個數(shù)為3.1×106 個·mL-1.
2.2 試劑與儀器
試劑：氨水，乙醇(純度>90%)，濃鹽酸，稀鹽酸，三氯酚(TCP)(化學(xué)純)，4-氨基安替比林，鐵氰化鉀，NaCl，緩沖溶液.
主要儀器：Agilent1200系列液相色譜儀(安捷掄)，電子天平(METTLER TOLEDO);UV2450PC紫外可見分光光度計(島津);DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海榮豐);LRH-250Ⅱ微電腦控制生化培養(yǎng)箱(廣東醫(yī)療);THZ-C恒溫振蕩器(培英);SW-CJ-1F單人水平垂直兩用凈化工作臺(蘇州凈化);MLS-3750高壓蒸汽滅菌器(三洋);CF-RXⅡ高速冷凍離心機(日立).
2.3 TCP的降解條件
取0.05 g過濾出的菌體(濕重)的菌體孢子懸濁液(600 nm處吸光度為0.16～0.165)，加入50 mL液體培養(yǎng)基濃度一定的TCP溶液中，在一定溫度、pH、150 r·min-1下繼續(xù)培養(yǎng)，每間隔24 h測定TCP濃度，分別研究溫度、pH、外加碳源、氮源、氯離子及TCP初始濃度對其降解效率的影響. 溫度影響實驗條件為pH 7.0，TCP初始濃度為30 mg·L-1，溫度25 ℃、30 ℃和35 ℃. pH影響實驗條件為30 ℃，TCP初始濃度為30 mg·L-1，pH為2.0~8.0. 外加碳源影響實驗條件為30 ℃、pH 7.0，TCP初始濃度為30 mg·L-1，葡萄糖(1 g·L-1、3 g·L-1、5 g·L-1). 氮源影響實驗條件為30 ℃、pH 7.0，TCP初始濃度為30 mg·L-1，氮源物質(zhì)為NH4Cl、NaNO2、蛋白胨、NH4NO3和NaNO3(濃度均為0.2 g·L-1). 氯離子影響實驗條件為30 ℃、pH 7.0，TCP初始濃度為30 mg·L-1，NaCl濃度為0~0.6 g·L-1. TCP濃度影響實驗條件為30 ℃、pH 7.0，TCP初始濃度為10~50 mg·L-1. 平行試驗3次，取其平均值.
2.4 動力學(xué)分析
根據(jù)微生物對底物降解速率與底物濃度的關(guān)系，可將這種反應(yīng)分為不同的級數(shù)方程. 當?shù)孜锝到馑俾什皇芊磻?yīng)物濃度影響時，為零級方程. 在溫度不變的情況下，零級方程的降解速率是常數(shù). 本文擬用零級降解動力學(xué)方程對實驗數(shù)據(jù)進行擬合.
2.5 降解產(chǎn)物分析
取不同的降解時間的5 mL培養(yǎng)液于5000 r·min-1，4 ℃離心10 min后，取上清液作為測定樣，以酸化樣為空白對照，堿化樣做測定樣，于190~600 nm范圍內(nèi)進行紫外掃描，以分析上清液溶質(zhì)組分差異.
取不同的降解時間的10 mL培養(yǎng)液于10000 r·min-1，4 ℃離心10 min，過濾上層清液. 再用等體積的乙酸乙酯萃取其中的有機物質(zhì)，氮吹濃縮至1 mL，直接進GC-MS分析，氦氣流速為0.8 mL·min-1. 柱溫為50 ℃，保留5 min，再以20 ℃·min-1程序升溫至280 ℃，保留10 min. 進樣口和檢測器溫度分別為250 ℃和300 ℃.
2.6 分析方法
采用高效液相色譜法(HPLC)對TCP濃度進行測定. 分析儀器為Agilent1200液相色譜儀，色譜柱為Diamonsil C18(2)150 mm×4.6 mm×5 μm，20 μL進樣器，流動相為1%冰乙酸水溶液:1%冰乙酸乙腈溶液=7∶3(體積比)，流速為1 mL·min-1，檢測波長為280 nm. TCP降解率的計算：
式中，C0、Ct分別為降解初始、時間t時TCP的濃度(mg·L-1).
3 結(jié)果與討論(Results and discussion) 3.1 溫度對TCP降解的影響
圖 1是不同溫度條件下鐮刀菌對TCP的降解效果. 由圖 1可知，在25~35 ℃條件下，鐮刀菌均能以TCP為唯一碳源和能源物質(zhì)進行生長. 在30 ℃時，TCP完全降解僅需3 d;而25 ℃和35 ℃時，TCP完全降解則需4 d. 這與鐮刀菌體內(nèi)TCP相關(guān)降解酶活性有關(guān)，可能是30 ℃時TCP降解酶活性最強所致.
圖 1 溫度對TCP 降解的影響
3.2 pH對TCP降解的影響
圖 2為不同pH條件下鐮刀菌對TCP的降解影響. 由圖 2可知：pH=7時鐮刀菌對TCP的降解速率最快，3 d降解完成;而pH=6時鐮刀菌對TCP的降解速率稍慢，但TCP完全降解也只需3 d. 當pH=8時鐮刀菌對TCP降解受到了一定的抑制，4 d時TCP降解率為97%. 此外，當pH=2或pH=4時，鐮刀菌對TCP幾乎沒有降解能力. 因此，可認為鐮刀菌在中性或者弱酸弱堿環(huán)境中利用TCP進行生長，最適pH=6~7.
圖 2 pH 對TCP 降解的影響
3.3 外加碳源對TCP降解的影響
圖 3是添加不同濃度的外加碳源葡萄糖鐮刀菌對TCP降解影響. 由圖 3可知，鐮刀菌可利用TCP為唯一碳源和能源物質(zhì)進行生長繁殖，30 mg·L-1的TCP只需3 d即可完全降解，但觀察到鐮刀菌的生長受到了嚴重的抑制. 這是由于葡萄糖與TCP為共基質(zhì)時，鐮刀菌首先利用葡萄糖，在代謝產(chǎn)生了一些酸性中間產(chǎn)物(實測pH由6降到了2.3)，使培養(yǎng)液呈強酸環(huán)境，抑制了鐮刀菌的生長，這與劉艷霞等研究結(jié)果一致(劉艷霞等，2012).
圖 3 外加碳源葡萄糖對TCP 降解的影響
3.4 氮源對TCP降解的影響
圖 4為不同氮源對鐮刀菌降解TCP的影響. 由圖 4可知，氮源為蛋白胨時，TCP降解速率最快，完全降解僅需3 d;氮源為NaNO3時，TCP的降解速率次之，但TCP完全降解也僅需3 d. 當?shù)次镔|(zhì)為NaNO2時，鐮刀菌對TCP的降解受到了明顯的抑制，此時鐮刀菌菌體不能生長. 因此，考慮到實用經(jīng)濟性，鐮刀菌降解TCP最適氮源為NaNO3.
圖 4 氮源對TCP 降解的影響
3.5 氯離子對TCP降解的影響
圖 5為氯離子濃度對TCP降解的影響. 由圖 5可知，低濃度Cl-(0.2 g·L-1)對鐮刀菌降解TCP具有一定的促進作用，但隨著Cl-濃度的增加，TCP的降解受到了抑制，且Cl-濃度越高，其抑制作用越強. 這說明Cl-是鐮刀菌生長所必須的，但Cl-濃度過高時則會對TCP脫氯過程產(chǎn)生抑制，從而減緩了鐮刀菌對TCP的降解速率. 這與Kargi等研究結(jié)果相一致，認為多氯酚物質(zhì)在微生物體內(nèi)的代謝主要是一個脫氯的過程，氯離子的存在會對鐮刀菌降解TCP的脫氯過程產(chǎn)生影響(Kargi and Eker，2004，2005;Jesús et al.，2009).
圖 5 氯離子濃度對TCP 降解的影響
3.6 濃度對TCP降解的影響
濃度對鐮刀菌降解TCP的影響如圖 6所示，當TCP濃度在10~50 mg·L-1范圍內(nèi)時，鐮刀菌均可將其完全降解. 鐮刀菌對TCP的降解速率則隨著TCP濃度的增加而逐漸減緩. 當TCP濃度為10 mg·L-1時，鐮刀菌對其完全降解最快只需2 d即可完成;但當TCP濃度提高到50 mg·L-1時，鐮刀菌對其完全降解則需4.5 d才能完成.
圖 6 鐮刀菌對TCP 的降解零級動力學(xué)擬合曲線
3.7 降解動力學(xué)
圖 6為不同濃度條件下鐮刀菌降解TCP的動力學(xué)擬合曲線. 由圖 6可知，在不同濃度條件下，TCP濃度均隨著降解時間的增加而不斷降低，濃度與降解時間呈較好的線性關(guān)系，R2維持在0.87~0.95范圍內(nèi)(表 1)，說明鐮刀菌對TCP的降解符合零級降解動力學(xué)方程.
表 1 鐮刀菌對TCP 的降解零級動力學(xué)參數(shù)
3.8 降解產(chǎn)物與途徑分析
圖 7是鐮刀菌以TCP為唯一碳源和能源物質(zhì)時的降解產(chǎn)物紫外掃描圖. 在圖 7中，TCP的特征吸收波長為325 nm，隨著時間推移，其特征峰逐漸消失. 當降解4 d時，其特征峰則完全消失，沒有新的峰產(chǎn)生，這說明TCP已被完全降解.
圖 7 鐮刀菌降解TCP 的產(chǎn)物紫外掃描曲線
圖 8為鐮刀菌對TCP降解2 d的氣相色譜圖，圖 9為TCP降解產(chǎn)物的質(zhì)量色譜圖. 由圖 8與圖 9知，TCP的保留時間為12.521 min，特征離子m/z為196. 此外，在10.355 min時也出現(xiàn)了一個較為明顯的峰(圖 8)，特征離子m/z為162，經(jīng)NIST檢索為2，6-二氯苯酚，根據(jù)相關(guān)資料可推斷其可能為TCP降解中間產(chǎn)物(Spain et al.，1989;全向春等，2003).
圖 8 鐮刀菌降解TCP 中間產(chǎn)物的GC 圖譜
圖 9 TCP 降解產(chǎn)物的質(zhì)量色譜圖
文獻(Li et al.，l1991)認為，Azotobacter sp.等對TCP代謝降解途徑主要是偏苯三酚途徑，是在2，4，6-TCP-4-單加氧酶(同時存在FADH2和NADH)的作用下依次將對位和鄰位上的氯原子脫去并氧化，形成2，6-二氯對苯二酚，再進一步代謝為6-氯偏苯三酚，進一步脫氯后形成偏苯三酚，然后在偏苯三酚1，2-雙加氧酶的作用下鄰位開環(huán)形成馬來酰乙酸，最后進入三羧酸循環(huán)進行完全礦化. 在厭氧條件下微生物對TCP的降解途徑是通過直接鄰位/對位脫氯生成2，4-二氯苯酚/2，6-二氯苯酚，再分別通過鄰位或?qū)ξ幻撀壬杀椒�，最后被礦化(Kennes et al.，l1996; Nicholson et al.，l1992 ).根據(jù)實驗結(jié)果，可推測得出鐮刀菌對TCP的降解途徑如圖 10所示. 它是通過2，6-二氯苯酚途徑進行降解的，這是一個直接脫氯的過程. TCP首先經(jīng)過對位脫氯形成2，6-二氯苯酚，2，6-二氯苯酚再通過鄰位脫氯形成2-氯苯酚，最后2-氯苯酚鄰位脫氯形成苯酚，隨后進入三羧酸循環(huán)，完全礦化.
圖 10 鐮刀菌對TCP 的降解途徑
4 結(jié)論(Conclusions)
1) 鐮刀菌降解TCP的最適條件為：氮源NaNO3(0.2 g·L-1)，30 ℃，pH=6~7. 外加碳源葡萄糖對降解TCP具有明顯的抑制作用. 氯離子濃度低于0.2 g·L-1時對鐮刀菌降解TCP具有一定的促進作用，但隨著氯離子濃度的增加，TCP的降解受到了抑制. 鐮刀菌對TCP降解速率隨著其濃度的升高而減緩.
2) 鐮刀菌能降解10~50 mg·L-1的TCP，對其降解反應(yīng)符合零級降解動力學(xué)方程.具體參見污水寶商城資料或http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
3) 當以TCP為唯一碳源和能源物質(zhì)時，TCP特征峰均隨著降解時間的延長而逐漸消失，且無新峰產(chǎn)生. 鐮刀菌降解TCP過程中可檢測到2，6-二氯苯酚(RT 12.521 min)的存在，可認為是通過2，6-二氯苯酚途徑進行反應(yīng)降解.
