1 引言(Introduction)
苯酚(phenol)作為一種原生質毒物，對環(huán)境造成嚴重污染，長期飲用被苯酚污染的飲用水或食物，對人類的健康將造成極大的危害，苯酚對人體皮膚、粘膜有強烈的腐蝕作用，可抑制中樞神經或損害肝、腎功能，吸入高濃度蒸氣可致頭痛、頭暈、乏力、視物模糊、肺水腫等.因此，美國環(huán)保署把苯酚列入129種優(yōu)先污染物和65種有毒污染物之列，中國也將苯酚列入環(huán)境優(yōu)先處理的污染物“黑名單” 之中(Basha et al.，2010).
國內外苯酚主要的生產方式為氯苯水解法、苯磺酸鈉堿熔法、異丙苯氧化法等，為了提高苯酚產量，常在生產過程中加入無機鹽催化劑，并進行pH調節(jié)，此過程會使得體系中鹽度增大，后期廢水中不僅含有苯酚等有機污染物，也含有大量的鹽分(Ca2+、Mg2+、Cl-、Na+)使廢水難以處理.目前含酚廢水處理手段主要有兩大類，即生物處理法和物理處理法.由于生物處理法具有操作較簡單、成本低廉、處理效果好、所需要的環(huán)境條件比較溫和、對環(huán)境造成的二次污染很小等優(yōu)點，已被廣泛用于苯酚廢水的處理之中.目前國內外學者在苯酚廢水處理方面做了大量的研究，并篩選出多種具有良好苯酚降解效果的苯酚降解菌，但是這些菌耐鹽能力弱，當酚類廢水中鹽度超過一定濃度，其生長以及降解苯酚的效果會受到嚴重影響.利用耐鹽高效苯酚降解菌株對苯酚進行降解，不僅可以有效的降解廢水中的苯酚，也解決了一般菌株在高鹽條件下難以降解苯酚的難點.另外，對微生物苯酚降解效果產生影響的因素較多，傳統(tǒng)的單因素實驗難以區(qū)分各個因素之間的主次,所以尋求耐鹽高效苯酚降解菌及其最佳降解條件具有重要意義.
本實驗以海利(常德)有限公司污水處理池中提取的水樣為菌源，通過篩選、分離、馴化得到在高鹽條件下以苯酚為唯一碳源能源的苯酚降解菌，經耐鹽和苯酚降解能力測定，得到耐鹽高效苯酚降解菌zhtI.對耐鹽高效苯酚降解菌zhtI菌落形態(tài)、菌體特征、生理生化反應、16S rRNA序列分析確定菌株的種屬，利用響應面法(RSM)進行優(yōu)化處理從而提高苯酚降解菌zhtI的降解效率，并對耐鹽高效苯酚降解菌zhtI進行降酚動力學研究，研究結果將為生物法處理苯酚廢水提供新的技術思路.
2 材料與方法(Materials and methods) 2.1 樣品來源及耐鹽高效苯酚降解菌的分離與純化
以海利(常德)有限公司苯酚廢水處理池所取水樣作為篩選苯酚降解菌株的菌源.通過逐漸提高苯酚濃度的馴化方法，將水樣樣品按2% 的接種量接種于以100 mg · L-1苯酚為唯一碳源，鹽度2%的無機鹽培養(yǎng)基中;溫度30 ℃、搖床轉速200 r· min-1，好氧培養(yǎng)2 d 后，以2%接種量轉接至苯酚濃度為200 mg·L-1，鹽度2%的無機鹽培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，直到苯酚濃度達到1000 mg·L-1;然后進行平板涂布，將培養(yǎng)皿放于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，挑取單菌落，轉接至苯酚濃度1000 mg·L-1，鹽度2%的無機鹽培養(yǎng)基中;經反復平板涂布，最后篩選出具有耐鹽高效苯酚降解能力的菌株，保存在鹽度2%，苯酚濃度為100 mg·L-1的LB固體培養(yǎng)基上.
2.2 培養(yǎng)基
富集培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)：蛋白胨10 g·L-1，酵母膏5 g·L-1，鹽度2%，pH值7.0，121 ℃下滅菌20 min，備用(LB固體培養(yǎng)基需加入18%瓊脂粉).
無機鹽培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)：KH2PO4 1 g·L-1，NaCl 0.1 g·L-1，(NH4)2SO4 0.04 g·L-1，MnSO4 .H2O 0.01 g·L-1，NaH2PO4 0.4 g·L-1，MgSO4.7H2O 0.1 g·L-1，F(xiàn)e2(SO4)3.H2O 0.01 g·L-1，NaMo4.2H2O 0.01 g·L-1，加水定容至1000 mL，121 ℃下滅菌20 min，備用.
2.3 實驗方法 2.3.1 菌體細胞濃度測定
用分光光度計，測定光密度(OD值)設定為600 nm，進行菌體濃度測定.
2.3.2 苯酚濃度的測定
運用4-氨基安替比林法測定苯酚的含量(潘杰等，2015).
2.3.3 形態(tài)特征鑒定
用肉眼觀察菌落的形狀、大小、顏色、邊緣特點、透明度、粘稠度、濕潤度以及是否隆起.通過染色劑對降解菌進行染色(革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色、莢膜染色等)，在高倍顯微鏡下觀察染色結果，并用掃描電鏡觀察菌體表面形態(tài).
2.3.4 生理生化特性的測定
按照《伯杰氏細菌鑒定手冊》(Garrity，1974)進行甲基紅實驗、過氧化氫酶實驗、吲哚實驗、淀粉水解實驗、硝酸鹽還原實驗、乳糖氧化發(fā)酵、明膠液化實驗、VP實驗、精氨酸雙水解途徑檢測.
2.3.5 16S rDNA序列分析
擴增通用引物： 27F 5′-AGACTTTGATCCTGGCTCAG -3′，1492R 5′-ACGGTT ACCTGTTACGACTT-3′
擴增體系設計：模板 DNA液10 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 1 μL、Taq 酶 2 μL、兩種引物各1 μL、ddH2O 31 μL.
PCR擴增反應條件：95 ℃(5 min)預變性→[95 ℃(30 s)→55 ℃(30 s)→72 ℃(90 s)](35cycles)→72 ℃(10 min)→4 ℃(holding)
PCR擴增產物電泳實驗，獲得目的條帶，將PCR擴增產物交上海生工生物工程有限公司進行測序，將測序結果進行16S rRNA序列分析確定菌株的種屬.
2.4 降解條件優(yōu)化
實驗選取苯酚濃度、葡萄糖濃度、接種量、溫度、pH值、鹽度等6個對菌株zhtI降解苯酚影響最明顯的因素，根據(jù)Placket-Burman實驗設計原理，對11個考察因素進行N=12的組合實驗，以苯酚降解率為響應值，從中篩選出對菌株降解苯酚影響最顯著的3個因素;再通過中心組合實驗設計原理，以Box-Benhnken設計進行實驗，最后用Design Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，得到最佳降解條件組合.2.5 耐鹽苯酚降解菌的降酚動力學研究
本文在降解菌的最佳培養(yǎng)條件下，以苯酚作為唯一碳源和能源，測定菌株對NaCl的最大耐受能力，根據(jù)每次實驗測得的苯酚濃度和菌體生長量，求出不同苯酚濃度所對應降解速率，然后求出比降解速率值，最后運用origin7.5軟件對實驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合，得出相應的動力學參數(shù)，鑒定菌株是否符合底物抑制模型.
3 結果與討論(Results and discussion) 3.1 菌株的分離及鑒定 3.1.1 菌株的分離
通過逐步提高苯酚濃度，從挑取的97個單菌落中分離純化得到12株具有耐鹽高效苯酚降解能力的菌株，分別命名為zhtA、zhtB、zhtC、zhtD、zhtE、zhtF、zhtG、zhtH、zhtI、zhtJ、zhtK、zhtL.對分離純化得到的12株耐鹽高效苯酚降解株進行降酚能力的測定，其中菌株zhtI的降解效果最佳，苯酚的降解率達到了80%以上.由此可知，在高鹽條件下菌株zhtI對苯酚的降解能力最強.
3.1.2 菌株的鑒定
對菌株進行形態(tài)特征鑒定，結果顯示，菌株zhtI菌落呈圓形、白色、邊緣整齊、中間隆起、濕潤有光澤、較粘稠、不產色素，呈桿狀，無端生鞭毛，無莢膜結構，無芽孢結構.菌株zhtI的革蘭氏染色陽性、甲基紅實驗陰性、過氧化氫酶陽性、吲哚實驗陰性、精氨酸雙水解酶實驗陽性、VP實驗陰性、淀粉水解實驗陰性、硝酸鹽還原實驗陽性、乳糖氧化發(fā)酵陰性、明膠液化實驗陽性.根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》初步確定菌株zhtI為不動桿菌屬(Acinetobacter sp.).
圖 1 菌株zhtI的菌落形態(tài)及掃描電鏡
菌株zhtI的16S rDNA經過PCR擴增得到一條大小在1400 bp左右的片段.測序得到菌株zhtI的16S rDNA核苷酸序列全長為1339 bp.經過BLAST同源性比對，菌株zhtI與Acinetobacter guillouiae(Genbank登錄號為：KC904085)的同源性達到100%，按照16S rDNA序列的同源性在97%即為同一個種的標準,初步鑒定菌株zhtI為一株Acinetobacter guillouiae.菌株zhtI的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 2所示.
圖 2 菌株zhtI的系統(tǒng)發(fā)育樹
3.4 菌株降酚效率的影響因素及降酚條件優(yōu)化 3.4.1 培養(yǎng)條件對降酚效率的影響及分析
通過單因素實驗得出，NaCl濃度為3%時，菌株zhtI對苯酚的降解率達到最大值85.4%.在苯酚濃度為800 mg·L-1時，降解率達到最大值87.1%;當苯酚濃度高于800 mg · L-1時，菌株zhtI的生長量及其對苯酚的降解率均逐步下降;當pH值為7.5時，菌株zhtI對苯酚的降解率達到最大值;當接種量為6%時，菌株的生長量和苯酚降解率最高，而當接種量超過6%時，菌株的生長量和苯酚降解率變化均不明顯;當溫度為30 ℃時，菌株zhtI對苯酚的降解率達到最大值，當溫度高于30 ℃時，菌株zhtI對苯酚的降解率和生長量均下降;外加碳源對菌株zhtI降解苯酚的效率影響較大，初始過程中菌株降解苯酚受到一定抑制，這是由于外加碳源被優(yōu)先利用，但在后期苯酚的降解率上升明顯，其中添加葡萄糖對菌株zhtI降解苯酚的促進作用最佳，能使苯酚的降解率達到91.6%;外加硝酸類氮源會使菌株zhtI降解苯酚的效率受到抑制，培養(yǎng)基中存在的NO-3是苯酚降解酶系的非競爭性抑制劑，使酶的活性降低，這與以硝酸鹽作為外加氮源會影響或抑制菌株對苯酚的降解研究結果一致.
3.4.2 菌株zhtI降酚條件的優(yōu)化
(1) Placket-Burman實驗結果
根據(jù)Placket-Burman設計原理得出實驗結果如表 1所示.
表 1 Placket-Burman實驗設計結果
從表 1可知，實驗組5的苯酚降解率最高，達到93.79%;實驗組12的苯酚降解率最低為40.37%.運用SPPS 19.0軟件進行擬合，得到方程：Y=69.93-8.71X1+43X2+9.85X3-0.62X4+4.71X5-1.14X6
X1表示苯酚濃度(mg · L-1);X2表示葡萄糖濃度(%);X3表示pH值;X4表示接種量(%);X5表示溫度(℃);X6表示鹽度(%).
通過Design Expert軟件分析得到模型P=0.0355，說明該模型在研究區(qū)域擬合性良好;一般情況下變化系數(shù)越低說明實驗的可信度和精確度越高，本實驗變化系數(shù)為11.78%，表示Placket-Burman實驗可信度和精確度比較高.線性回歸分析結果如表 2所示.
表 2 Placket-Burman實驗分析結果
從表 2可知苯酚濃度、葡萄糖濃度及pH值對菌株zhtI降解苯酚的影響比較顯著，其影響大小順序為苯酚濃度(P=0.0134)>pH值(P=0.0193)>葡萄糖濃度(P=0.0211)，其它因素對菌株zhtI降解苯酚的影響P值均大于0.05，所以影響效果不顯著.由此可推斷，酚濃度、葡萄糖濃度及pH為影響菌株zhtI降解苯酚的關鍵因素.
(2) 響應面法對菌株zhtI降酚條件的優(yōu)化
由2.5.1 節(jié)篩選出3個對菌株zhtI苯酚降解效率產生影響的主要因素，即苯酚濃度、葡萄糖濃度、pH值，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設計原理,以苯酚降解率作為響應值，設計3因素3水平的響應面分析實驗，組合方案見表 3.
表 3 中心組合實驗方案
苯酚濃度A、 葡萄糖濃度B、pH值C作如下變換Z1=(A - 800)/10、 Z2=(B-6)/1、Z3=(C-7.5)/10，以A、B和C為自變量，以苯酚降解率(Y)為響應值進行實驗設計.結合響應面分析三維圖(圖 3)，可更加直觀地看出各個因素之間的相互作用，以及各個因素對苯酚的降解不是簡單的線性關系，對響應值大小的影響存在一極值點.
圖 3 影響菌株zhtI降解苯酚的各因素交互作用響應曲面
采用SAS RSREG程序對響應值與各因素進行處理，進行回歸擬合后，得到回歸方程：
Y=93.08+0.91Z1-2.66Z2-0.33Z3-2.72Z1Z2-0.40Z1Z3+1.00Z2Z3-2.90Z21-3.10Z22-10.582Z3，以及回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗結果見表 5.
從表 4方差分析結果(F值)可得，對苯酚降解效率產生影響的3個因數(shù)大小依次為：葡萄糖濃度(Z2)>苯酚濃度(Z1)>pH值(Z3)，其中失擬項數(shù)值大小為0.331 7，大于0.05，表示失擬不顯著，因此該模型穩(wěn)定，可作為各個因素水平對苯酚降解率影響的預測.根據(jù)回歸方程，得到A=801.6，B=5.56，C=7.3，即苯酚濃度為801.6 mg·L-1，葡萄糖濃度為5.56%，pH值為7.3.將Z1、Z2、Z3代入回歸方程可得Y=93.23，即菌株zhtI能使苯酚的降解率達到93.23%.
表 4 Box-Behnken實驗回歸分析結果
(3) 驗證實驗
為了檢驗響應面分析方法的可靠性，按照優(yōu)化后的條件(苯酚濃度801.6 mg·L-1、葡萄糖濃度5.56%、pH值7.3、接種量6%、溫度30 ℃、鹽度3%)進行苯酚降解實驗(3次平行實驗)，培養(yǎng)72 h，結果檢測到苯酚降解率分別為93.68%、92.47%、93.02%，取平均值為93.06%，預測值與實驗結果之間偏差非常小，具有良好的擬合性，優(yōu)化后菌株zhtI對苯酚的降解能力得到提升.說明響應面法能有效的對實驗條件進行優(yōu)化和預測，節(jié)約成本.
3.5 菌株zhtI的降酚動力學研究 3.5.1 菌株zhtI對苯酚耐受性檢測結果
菌株zhtI在pH值7.3、接種量6%、溫度30 ℃、鹽度3%、搖床轉速200 r·min-1的不同苯酚濃度MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h.菌株zhtI的最高耐受苯酚濃度為1750 mg·L-1，當苯酚濃度過高時，菌株zhtI的生長會受到抑制甚至失活.對菌株zhtI進行降酚的動力學研究，降酚解動力學的相關數(shù)據(jù)如表 5所示.
表 5 菌株zhtI苯酚降解動力學實驗數(shù)據(jù)
圖 4 苯酚降解模型動力學方程擬合曲線與實驗值
4 結論(Conclusions)
1) 將篩選出的耐鹽高效苯酚降解菌zhtI進行菌落形態(tài)、個體特征、生理生化鑒定，初步確定菌株zhtI為不動桿菌屬(Acinetobacter sp.).對菌株菌株zhtI進行16S rDNA基因測序分析，通過BLAST與Genbank中相關序列比對以及MEGA4.1構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株zhtI為Acinetobacter guillouiae.
2) 通過單因素實驗確定菌株最適鹽度為3%，最適苯酚濃度為800 mg·L-1，最適pH值為7.5，最適接種量為6%，最適生長溫度為30 ℃，最適外加碳源為葡萄糖，外加NO-3類氮源對菌株降解苯酚有抑制作用;利用Plackett-Burman實驗確定葡萄糖濃度、苯酚濃度、pH值為菌株降解苯酚的3個主要因素，采用中心組合實驗設計，結合Box-Behnken實驗設計及響應面分析，確定最優(yōu)降解條件為：苯酚濃度801.6 mg·L-1、葡萄糖濃度5.56%、pH值7.3、接種量6%、溫度30 ℃、鹽度3%，該條件下培養(yǎng)72 h，菌株zhtI對苯酚的降解率可達到93.23%具體參見污水寶商城資料或http://www.yiban123.com更多相關技術文檔。
3) 菌株zhtI以苯酚為唯一碳源，接種于pH值7.3、接種量6%、鹽度3%、溫度30 ℃的液體MS培養(yǎng)基中，搖床轉速200 r·min-1培養(yǎng)72 h，菌株zhtI對苯酚的最大耐受濃度為1750 mg·L-1.菌株zhtI降解苯酚的動力學模型符合典型的底物抑制模型，動力學參數(shù)為：μmax=2.142 h-1，KS=126.952 mg·L-1，Ki=476.191 mg·L-1.
