1 引言
為了有效地控制水體富營養(yǎng)化，強(qiáng)化生物除磷(Enhanced Biological Phosphorus Removal，簡(jiǎn)稱EBPR)在廢水生物處理磷過程中起到了關(guān)鍵性作用(Oehmen et al., 2007).EBPR即在厭氧-好氧交替運(yùn)行條件下，活性污泥中的聚磷微生物選擇性地富集成優(yōu)勢(shì)菌群，厭氧階段，聚磷菌(PAOs)通過分解胞內(nèi)聚磷產(chǎn)生的能量，吸收胞外的揮發(fā)性脂肪酸，同時(shí)降解糖原提供還原力以合成聚β羥基烷酸酯(PHA);好氧階段，聚磷菌利用分解胞內(nèi)的PHA產(chǎn)生的能量，用于細(xì)胞生長、聚磷合成和糖原恢復(fù)，通過好氧末端排泥實(shí)現(xiàn)生物除磷的目的.
糖原是強(qiáng)化生物除磷過程中產(chǎn)生的一種胞內(nèi)聚合物.PAOs在厭氧條件下吸收基質(zhì)不僅需要利用分解多聚磷酸鹽產(chǎn)生的能量，還需要糖原為其提供部分能量和還原力.因此，提供一種快速的分析污泥胞內(nèi)糖原含量變化的方法將有助于對(duì)強(qiáng)化生物除磷原理的進(jìn)一步認(rèn)識(shí).目前，污泥胞內(nèi)糖原的化學(xué)測(cè)定主要利用蒽酮比色法.測(cè)定原理主要是將冷凍干燥污泥進(jìn)行不同方式的預(yù)處理，利用強(qiáng)酸可使糖類脫水生成糖醛，生成的糖醛或羥甲基糖醛與蒽酮脫水縮合，形成藍(lán)綠色的糖醛衍生物，該物質(zhì)在600~650 nm波長處有最大吸收，可以得到吸光度值與糖原含量的線性關(guān)系(Chen et al., 2005).
利用蒽酮法測(cè)定污泥胞內(nèi)糖原含量比較繁瑣，且容易造成污泥樣品的不可逆性破壞.污泥的紅外光譜分析亦是一種測(cè)定污泥胞內(nèi)糖原含量的重要分析方法，近年來，伴隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，傅里葉紅外光譜技術(shù)在科研領(lǐng)域逐漸得到了廣泛使用.紅外光譜技術(shù)可以對(duì)微克級(jí)甚至是納克級(jí)樣品進(jìn)行定性和定量分析，具有過程簡(jiǎn)便、噪聲低、光通量高、分辨率高、波數(shù)準(zhǔn)確度高、測(cè)定的光譜范圍寬和掃描速度快等優(yōu)點(diǎn)(翁詩甫，2005).
糖原是由葡萄糖通過化學(xué)鍵而聚合在一起的多聚物，具有特征的紅外光譜吸收峰.Garip等(2009)通過研究Micrococcus 種屬的細(xì)菌的紅外光譜發(fā)現(xiàn)，糖原的紅外吸收峰分別位于1074 cm-1和550 cm-1 處.Mehrotra等(2007)通過研究人體組織中正常細(xì)胞與癌癥細(xì)胞的紅外光譜，考察了蛋白、核酸和糖原的特征峰的峰位和峰強(qiáng)，比較了糖原與蛋白的峰強(qiáng)之比，定性和半定量地評(píng)價(jià)了從正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程.因此，通過糖原特征峰強(qiáng)度的變化可以定性或者半定量表征糖原含量的變化.進(jìn)一步而言，還可以采用偏最小二乘法(PLS)或者BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對(duì)各類樣品的紅外光譜進(jìn)行定量分析.例如，李振慶等(2009)采用改進(jìn)偏最小二乘回歸法將選出的波長區(qū)與巴氏殺菌純牛乳中脂肪、蛋白質(zhì)及乳糖成分建立模型，結(jié)果表明，模型的擬合程度較高，得到了很好的預(yù)測(cè)效果.林萍等(2009)應(yīng)用偏最小二乘法和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合的方法對(duì)白砂糖、木糖醇、雙歧糖和葡萄糖進(jìn)行了定性分辨和定量分析.活性污泥樣品是十分復(fù)雜的混合物，課題組以前的研究中也曾比較了污泥樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品的紅外光譜峰，初步確定了糖原的特征吸收峰，并采用特征峰強(qiáng)度比值對(duì)活性污泥中的糖原含量進(jìn)行了初步定量表征(李瑞，2012).然而，僅僅通過峰位比對(duì)來確定目標(biāo)物質(zhì)的特征吸收峰相對(duì)粗糙，若能采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)污泥中的糖原峰進(jìn)行定性表征，則可以得到糖原物質(zhì)在污泥樣品中的一系列特征吸收貢獻(xiàn)區(qū)域.在此基礎(chǔ)上，選定特征光譜區(qū)間并采用偏最小二乘法或人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法建立樣品紅外光譜與糖原含量的關(guān)系模型，則可以用于未知樣品的快速表征和定量分析.基于此，本文采用傅里葉中紅外光譜對(duì)強(qiáng)化生物除磷過程中污泥胞內(nèi)糖原物質(zhì)進(jìn)行表征，并將污泥樣品與糖原標(biāo)樣的紅外光譜進(jìn)行對(duì)比.同時(shí)，采用紅外光譜945~1150 cm-1區(qū)域內(nèi)的吸收光譜數(shù)據(jù)，結(jié)合測(cè)得胞內(nèi)糖原的含量，應(yīng)用偏最小二乘法和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法分別建立污泥紅外光譜與糖原含量的定量分析模型.
2 材料與方法
2.1 反應(yīng)器描述
采用序批式反應(yīng)器(SBR)富集聚磷菌，以實(shí)現(xiàn)強(qiáng)化生物除磷的目的.反應(yīng)器有效容積4 L，8 h一個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)進(jìn)水2 L，以乙酸鈉為唯一碳源，COD為400 mg · L-1，NH4Cl作為微生物的唯一氮源，KH2PO4與K2HPO4作為微生物的磷源，進(jìn)水中磷的濃度為20 mg · L-1，碳磷比為20 ∶ 1.單個(gè)循環(huán)時(shí)間設(shè)置見表 1.反應(yīng)器的水力停留時(shí)間為16 h，每個(gè)周期好氧末端排泥150 mL，污泥停留時(shí)間為8.9 d.
表1 反應(yīng)器各階段運(yùn)行時(shí)間
2.2 反應(yīng)器進(jìn)水組成
反應(yīng)器合成廢水由0.3 L溶液A和1.7 L溶液B組成，其中，溶液A和溶液B的組成成分見表 2.
表2 反應(yīng)器進(jìn)水組分一覽表
2.3 樣品采集與實(shí)驗(yàn)方法
待反應(yīng)器進(jìn)水完成后，分別在0、30、60、90、120(厭氧末端)、150、180、240、300 min(好氧末端)時(shí)進(jìn)行取樣，共進(jìn)行了3次平行試驗(yàn).對(duì)取得的所有樣品進(jìn)行泥水分離，得到上清液和濕污泥樣品.對(duì)濕污泥進(jìn)行抽濾，然后放入FD-1A-180冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥24 h，得到冷凍干燥污泥.取樣品上清液，根據(jù)《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》對(duì)COD和正磷酸鹽進(jìn)行檢測(cè)分析(魏復(fù)盛，2002).
冷凍干燥污泥的蒽酮比色測(cè)定方法如下：取10 mg冷凍干燥污泥，加入10 mL 75%的硫酸溶液反復(fù)振蕩，在100 ℃下消解10 min，取1 mL稀釋至10 mL，再從10 mL中取1 mL在冰水浴中加入蒽酮試劑(取0.2 g蒽酮溶解到80%硫酸中，以80%硫酸定容到100 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用)5 mL，轉(zhuǎn)移至沸水浴中加熱10 min，取出試管重新置于冰水浴冷卻至室溫，用分光光度計(jì)在620 nm處測(cè)定吸光度值.
采用中紅外透射法測(cè)量樣品時(shí)，基質(zhì)溴化鉀(KBr)與樣品的合理壓片過程能有效避免量測(cè)光譜時(shí)出現(xiàn)克里斯坦森效應(yīng)(黃冬晨等，2013).因此，冷凍干燥污泥的傅里葉紅外光譜檢測(cè)方法如下：利用KBr作為背景，將KBr用研缽壓制成薄片并放入傅里葉紅外光譜中掃描，得出背景光譜;在KBr中加入1%的待測(cè)污泥樣品，在研缽中進(jìn)行混勻后壓制成薄片再次放入傅里葉紅外光譜中掃描，得到待測(cè)污泥樣品的傅里葉紅外光譜圖.
3 結(jié)果與討論
3.1 反應(yīng)器的運(yùn)行狀態(tài)
圖 1是第一次實(shí)驗(yàn)的化學(xué)分析結(jié)果.從測(cè)得的化學(xué)指標(biāo)可以看出，反應(yīng)器進(jìn)水COD為166.5 mg · L-1，正磷酸鹽濃度為22.5 mg · L-1，經(jīng)過30 min的厭氧攪拌后，廢水中的COD基本完全降解，這可能是活性污泥的初期吸附所造成的底物濃度迅速下降;2 h后的厭氧末端COD降解到81.0 mg · L-1，正磷酸鹽濃度上升至160.5 mg · L-1，聚磷菌胞內(nèi)的釋磷量為進(jìn)水的6倍，說明伴隨著底物(乙酸鈉)的不斷降解，微生物胞內(nèi)的聚磷被利用降解成正磷酸鹽釋放到細(xì)胞外的水體中，導(dǎo)致水體中的正磷酸鹽含量增加，厭氧末端水體中的正磷酸鹽濃度達(dá)到最大.經(jīng)過后期3 h的曝氣處理后，伴隨著水體中COD的進(jìn)一步降解利用，水體中的正磷酸鹽被微生物過量吸收并以聚磷的形式儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)，好氧末端COD為48.0 mg · L-1，正磷酸鹽濃度為15.44 mg · L-1.通過每周期排150 mL污泥的形式達(dá)到了生物除磷的目的.
圖 1 SBR反應(yīng)器運(yùn)行過程中水質(zhì)指標(biāo)和胞內(nèi)糖原物質(zhì)含量的變化
在EBPR反應(yīng)器處理廢水過程中，糖原不僅可以為厭氧階段提供一部分能量，還可以為PHA的合成提供還原力.在厭氧階段所消耗的糖原伴隨著好氧階段PHA的分解利用和底物的進(jìn)一步消耗而得到了補(bǔ)充.從圖 1可以看出，在厭氧末端(120 min)，污泥胞內(nèi)糖原含量達(dá)到最低，占污泥總質(zhì)量的6.45%，經(jīng)過曝氣3 h后，污泥胞內(nèi)糖原的含量上升至8.78%.說明在生物除磷過程中，污泥胞內(nèi)的糖原物質(zhì)參與了微生物的活動(dòng).
3.2 標(biāo)準(zhǔn)污泥胞內(nèi)聚合物的紅外光譜分析
由于多糖分子中的C—OH伸縮振動(dòng)頻率與醇分子中的C—OH伸縮振動(dòng)頻率基本相同，位于1200~1000 cm-1之間，但多糖分子中又存在多個(gè)C—OH基團(tuán).因此，從圖 2a可以看出，在這個(gè)區(qū)域往往會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)峰位，圖中1020、1082和1158 cm-1處的特征峰是來自糖原分子中C—OH的吸收(Taylor et al., 2011).從圖 2b可以看出，聚磷(poly-P)的特征峰主要有兩個(gè)，一個(gè)位于1167 cm-1處的主峰和一個(gè)位于900 cm-1的次峰，它們分別是由PO2對(duì)稱伸縮振動(dòng)和P—OH基團(tuán)的伸縮振動(dòng)引起的吸收峰.從圖 2c和2d分別可以看出，PHB的紅外特征峰主要位于1723 cm-1處，牛血清蛋白(BSA)在1657 cm-1和1541 cm-1處分別有較強(qiáng)的I吸收峰、II吸收峰，這與之前文獻(xiàn)(Padermshoke et al., 2005; Adt et al., 2006)中報(bào)道的結(jié)果十分吻合.
圖 2 標(biāo)準(zhǔn)糖原、聚磷(多聚磷酸鹽)、PHB和牛血清蛋白(BSA)的紅外光譜圖
為了進(jìn)一步說明污泥胞內(nèi)糖原分子C—OH基團(tuán)在1020、1082和1158 cm-1處有很強(qiáng)的吸收峰，本文在污泥樣品中加入不同含量的標(biāo)準(zhǔn)糖原樣品，得到的光譜圖見圖 3.從圖 3可以看出，加入糖原后，紅外光譜在1020、1082和1158 cm-1處有顯著增加，并且隨著糖原投加比例的增加，其吸收峰強(qiáng)度明顯加強(qiáng)，其中，在1020 cm-1的吸光度分別從0.185增加為0.237和0.379.因此，應(yīng)該優(yōu)先選用該處的紅外峰作為糖原的特征峰.
圖 3 活性污泥中加入不同比例的標(biāo)準(zhǔn)糖原物質(zhì)后的紅外光譜圖
3.3 污泥樣品的紅外光譜分析
圖 4是第一次實(shí)驗(yàn)各取樣時(shí)間節(jié)點(diǎn)的污泥樣品紅外光譜圖，由于污泥樣品在1158 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度不是很明顯，故采用1020 cm-1與1082 cm-1處糖原分子的吸收峰強(qiáng)度來反映污泥胞內(nèi)糖原含量的變化.就1020 cm-1處的紅外吸收而言，進(jìn)水開始階段污泥胞內(nèi)的糖原分子的C—OH特征峰強(qiáng)度相對(duì)較高，吸收值為0.611.進(jìn)入?yún)捬蹼A段后，強(qiáng)度逐漸減弱，厭氧1 h后，降至0.585，到厭氧末期達(dá)到最低，降至0.549.經(jīng)過好氧階段處理后，胞內(nèi)糖原的特征峰強(qiáng)度明顯升高，好氧1、2、3 h的1020 cm-1處紅外峰吸光度分別為0.584、0.619和0.648，這顯然與蒽酮比色法測(cè)得的糖原含量變化趨勢(shì)是一致的.
圖 4 反應(yīng)器不同運(yùn)行節(jié)點(diǎn)的污泥樣品紅外光譜圖
3.4 污泥胞內(nèi)糖原含量的偏最小二乘和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法分析定量模型
采用前兩次實(shí)驗(yàn)獲得的18個(gè)樣品在945~1150 cm-1區(qū)域內(nèi)的中紅外光譜數(shù)據(jù)建立模型，并利用第3次實(shí)驗(yàn)獲得的9個(gè)污泥樣品數(shù)據(jù)驗(yàn)證模型的有效性.將光譜數(shù)據(jù)經(jīng)過歸一化處理后轉(zhuǎn)化為吸光度數(shù)據(jù)，利用偏最小二乘法建立光譜數(shù)據(jù)與化學(xué)指標(biāo)之間的定量分析模型，結(jié)果見圖 5和圖 6.
圖 5 交叉驗(yàn)證預(yù)測(cè)殘差平方和PRESS隨主成分個(gè)數(shù)的變化趨勢(shì)圖 
圖 6 提取的自變量和因變量信息隨主成分個(gè)數(shù)的變化趨勢(shì)圖
以光譜數(shù)據(jù)為自變量，以糖原的化學(xué)分析結(jié)果為因變量，利用偏最小二乘法提取自變量的主成分個(gè)數(shù).從圖 5和圖 6可以看出，隨著主成分個(gè)數(shù)的增加，交叉驗(yàn)證預(yù)測(cè)殘差平方和PRESS呈現(xiàn)出逐漸減小的變化趨勢(shì)，而提取的自變量和因變量信息卻一直呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì).當(dāng)自變量主成分個(gè)數(shù)為4時(shí)，PRESS基本已達(dá)到最低點(diǎn)，此時(shí)體現(xiàn)了99.52%的自變量信息和98.68%的因變量信息.隨著主成分個(gè)數(shù)的繼續(xù)增加，PRESS有所增加，而體現(xiàn)的信息量卻變化很小，說明過擬合將噪聲組分添加到模型中后，模型預(yù)測(cè)效果會(huì)變差(朱爾一，2005;吳桂芳等，2008).故選擇該模型的最佳主成分個(gè)數(shù)為4，此時(shí)的測(cè)量值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)性如圖 7a示.
圖 7 測(cè)量值與預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)關(guān)系圖(a.PLS法；b.BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法)
BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法將選取的中紅外光譜數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練樣本集，污泥胞內(nèi)糖原的化學(xué)指標(biāo)作為測(cè)試樣本集.第一隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)為5個(gè)，采用的是雙曲正切S型傳遞函數(shù)(tansig);第二層輸出層神經(jīng)元個(gè)數(shù)為1個(gè)，采用的是線性傳遞函數(shù)(purelin)，利用彈性梯度下降法的訓(xùn)練函數(shù)(trainrp).網(wǎng)絡(luò)配置參數(shù)設(shè)置為訓(xùn)練顯示間隔50次，最大迭代次數(shù)500次，學(xué)習(xí)步長0.05，期望目標(biāo)誤差最小值為10-4.對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練10次，從10次訓(xùn)練結(jié)果中選擇相關(guān)程度最高的作為污泥胞內(nèi)糖原含量的預(yù)測(cè)模型.該預(yù)測(cè)模型的均方誤差(Mean Squared Error，MSE)隨循環(huán)次數(shù)的增加而減小，最終基本達(dá)到期望目標(biāo)誤差最小值，變化過程如圖 8所示，其相關(guān)關(guān)系如圖 7b所示.
圖 8 均方誤差(MSE)隨循環(huán)次數(shù)的變化趨勢(shì)圖
應(yīng)用偏最小二乘法和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法分別建立污泥樣品的紅外光譜與胞內(nèi)糖原的化學(xué)指標(biāo)之間的分析定量模型，這兩種模型得出糖原的測(cè)量值與預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.921、0.893.并采用第3次實(shí)驗(yàn)的9個(gè)污泥樣品驗(yàn)證上述模型的有效性，其誤差分析比較見表 3.
表3 糖原百分含量的測(cè)量值與預(yù)測(cè)值的比較
偏最小二乘法模型的交叉驗(yàn)證均方根殘差RMSEC=0.22%，預(yù)測(cè)值的平均絕對(duì)誤差為0.19%，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法模型的預(yù)測(cè)值平均絕對(duì)誤差為0.32%，表明采用偏最小二乘法比神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法具有更小的平均絕對(duì)誤差. 由于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法的預(yù)測(cè)性受隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)的影響，其中，隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)過少，網(wǎng)絡(luò)中的權(quán)重不充分，此時(shí)的網(wǎng)絡(luò)不能夠較好地描述試樣集的固有規(guī)律，即不能夠得到很好的預(yù)測(cè)數(shù)學(xué)模型;隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)過多，會(huì)發(fā)生過擬合，使誤差變大(焦淑菲等，2010).而偏最小二乘法則不受這些因素的影響，并且在線性相關(guān)程度上也明顯優(yōu)于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法.因此，偏最小二乘法是污泥胞內(nèi)糖原物質(zhì)定量分析的一種快速有效方法.具體參見污水寶商城資料或http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
4 結(jié)論
1)在厭氧-好氧交替的強(qiáng)化生物除磷過程中，伴隨著底物乙酸鈉的降解，污泥胞內(nèi)的糖原存在著厭氧分解和好氧合成的兩個(gè)過程，其變化可以通過紅外光譜來表征.
2)污泥樣品的紅外光譜圖中位于1020 cm-1與1082 cm-1處的峰來自于糖原分子中C—OH的貢獻(xiàn)，該特征峰的強(qiáng)弱可以直觀地反映出在生物除磷過程中污泥胞內(nèi)糖原的變化過程.
3)利用偏最小二乘法和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法分別建立污泥樣品945~1150 cm-1區(qū)域的紅外光譜數(shù)據(jù)與蒽酮比色法測(cè)得的化學(xué)指標(biāo)之間的定量分析模型.結(jié)果顯示，偏最小二乘法比BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法預(yù)測(cè)污泥胞內(nèi)糖原物質(zhì)具有更好的預(yù)測(cè)精度和較小的平均絕對(duì)誤差，其測(cè)量值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)為0.921，平均絕對(duì)誤差達(dá)到0.19%.
