架橋細(xì)菌與活性污泥的共凝集及成膜能力研究

　　1 引言

　　共凝集是無(wú)親緣關(guān)系的細(xì)菌通過(guò)細(xì)胞表面分子進(jìn)行特異性識(shí)別進(jìn)而凝集在一起的行為，能夠特異性地增強(qiáng)配對(duì)微生物進(jìn)入生物膜的機(jī)會(huì).所謂架橋細(xì)菌(Bridge bacterium)，即是一類具有廣泛共凝集能力的細(xì)菌，它能與多種屬的細(xì)菌同時(shí)發(fā)生較強(qiáng)程度的共凝集，在多菌種生物膜形成中起到核心或橋梁作用.架橋細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)與研究最早出現(xiàn)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域(富饒等，2005;郭彤等，2004)，隨之在天然水體或污水處理等水環(huán)境領(lǐng)域里也陸續(xù)分離得到諸如藤黃微球菌(Micrococcus luteus)(Paster et al., 2001)、約氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjohnsonii s35)(Malik et al., 2003)和醋酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobacter cacoaceticusl)(Simes et al., 2008)等為數(shù)不多的架橋細(xì)菌.

　　生物膜是多種微生物細(xì)胞以主動(dòng)附著、吸附、凝集等方式固定于載體表面的復(fù)雜微生物群落(Sutherland et al., 2001)，這種自然固定化的微生物可在一定程度上通過(guò)基因表達(dá)譜的簡(jiǎn)單變化來(lái)適應(yīng)其它微生物種屬的存在，形成親密的或特殊的關(guān)系，從而衍生出穩(wěn)定性和適應(yīng)性更強(qiáng)的微生物群落(Mah et al., 2001;2003).Di Gioia 等(2004)研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)降解能力但有共凝集能力的Bacillus sp. VA160與2株具有壬基酚聚氧乙烯醚降解能力的菌株Acinetobacter sp. BCaL1和Stenothrophomonas sp. BCaL2共培養(yǎng)，2種細(xì)菌間凝集體的形成促進(jìn)了復(fù)雜有機(jī)物的降解.國(guó)內(nèi)也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，2株成膜力強(qiáng)的細(xì)菌與降解菌混合培養(yǎng)明顯增加了生物膜中降解菌的數(shù)量(Li et al., 2009;2008).

　　污水處理中常因降解菌的流失或不易定殖而無(wú)法長(zhǎng)期維持穩(wěn)定的降解效果，這一問(wèn)題始終困擾著生物強(qiáng)化技術(shù)的應(yīng)用和推廣.本課題組從多種廢水處理系統(tǒng)的生物膜中篩選出一株有廣泛共凝集能力且具有架橋作用的細(xì)菌—Bacillus cereus G5(杜青珍等，2010)，初步研究發(fā)現(xiàn)，G5可與6個(gè)屬的15株不同細(xì)菌發(fā)生較強(qiáng)程度的共凝集，并明顯促進(jìn)了生物膜量的增加，顯示出G5作為架橋細(xì)菌在促進(jìn)降解菌定殖上的應(yīng)用潛力.基于此，本研究檢測(cè)了G5與來(lái)源于同一批活性污泥中的13株土著菌和實(shí)驗(yàn)室已有的3株降解菌混合后的共凝集能力、生物膜形成能力及廢水處理效果的持久性，通過(guò)對(duì)架橋細(xì)菌能否以生物自固定化機(jī)制促進(jìn)降解菌定殖于生物膜的研究，探索生物強(qiáng)化處理中促進(jìn)降解菌定殖的新思路.

　　2 材料與方法

　　2.1 材料

　　活性污泥取自蘇州市婁江污水處理廠曝氣池.3，5-二硝基苯甲酸降解菌Comamonas testosteroni A3(李蒙英等，2007)、苯酚降解菌Pseudomonas P1、甲基對(duì)硫磷降解菌Pseudomonas putid DLL-1(劉智等，1999)及架橋細(xì)菌Bacillus cereus G5均為蘇州大學(xué)環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室保藏.

　　Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基：Tryptone 10 g · L-1，Yeast Extract 5 g · L-1，NaCl 10 g · L-1，pH 7.0~7.4.LB固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上另外添加1.5%~2.0%瓊脂.10%LB、5%LB則按比例稀釋.

　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法 2.2.1 土著菌分離

　　將采集的活性污泥放入無(wú)菌三角瓶中振蕩，用無(wú)菌生理鹽水系列稀釋后涂布于LB、稀釋10倍的LB(10%LB)、稀釋20倍的LB(5%LB)固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行分離培養(yǎng)，挑取單菌落，經(jīng)反復(fù)純化后的菌株分別于4 ℃和-80 ℃保藏備用.

　　2.2.2 菌懸液制備

　　分別將G5、降解菌及從活性污泥中分離得到的土著菌活化后接種于LB液體培養(yǎng)基，30 ℃、180 r · min-1振蕩培養(yǎng)20 h，5000 r · min-1離心5 min收集菌體，以0.1 mol · L-1、pH=7.0的PBS緩沖液洗滌2次后重懸，調(diào)菌懸液OD660至1.0左右備用.

　　2.2.3 共凝集率檢測(cè)

　　取制備好的2株配對(duì)細(xì)菌的菌懸液各5 mL，加入到15 mL無(wú)菌離心管，漩渦混均，室溫靜置孵育，分別于2 h和20 h時(shí)在500 r · min-1條件下離心1 min，660 nm下測(cè)上清液吸光值OD660(x+y);兩配對(duì)細(xì)菌的菌懸液各取10 mL，分別靜置孵育，以相同方法測(cè)上清液吸光值OD660x和OD660y，計(jì)算共凝集率R(Shen et al., 2005)：

　　式中，OD660(x+y)為某一組合中兩配對(duì)菌株的菌懸液混合孵育后的吸光值，OD660x和OD660y為兩配對(duì)菌株的菌懸液?jiǎn)为?dú)孵育后的吸光值.

　　2.2.4 成膜能力測(cè)定

　　采用結(jié)晶紫染色法(Zhu et al., 2003)測(cè)定生物膜量.將菌懸液按1%(V/V)接種量分別接種兩配對(duì)菌于裝有已滅菌的2 mL LB、10% LB、5%LB的玻璃試管中，30 ℃、180 r · min-1下振蕩培養(yǎng)24 h，輕輕倒去培養(yǎng)液，用去離子水洗去生物膜表面浮游細(xì)菌;加入0.1%結(jié)晶紫水溶液2 mL，室溫染色30 min，倒出染色液用去離子水輕輕洗滌2次;自然干燥后，加乙醇/丙酮溶液(80 ∶ 20，V/V)2 mL，洗脫吸附于生物膜上的染料，乙醇/丙酮溶液適當(dāng)稀釋后測(cè)570 nm處的吸光值，計(jì)算生物膜量.

　　2.2.5 凝集體觀察

　　采用電子顯微鏡觀察凝集體中菌體的組成和分布.

　　2.3 序批式生物膜反應(yīng)器 2.3.1 實(shí)驗(yàn)裝置與方法

　　裝置由有機(jī)玻璃板制成，尺寸為22 cm×14 cm×16 cm(長(zhǎng)×寬×高)，有效水深14 cm，有效容積5 L.內(nèi)部填充半軟性纖維復(fù)合填料與聚乙烯多孔球形懸浮填料，約占反應(yīng)器有效容積的30%左右，通過(guò)氣泵及曝氣砂頭進(jìn)行曝氣.不同反應(yīng)器設(shè)置方案如表 1所示.

表1 3，5-DNBA反應(yīng)器設(shè)置

　　2.3.2 工藝運(yùn)行

　　反應(yīng)器接種后悶曝24 h，換水2.5 L，之后每12 h換水2.5 L作為一個(gè)周期，繼續(xù)掛膜培養(yǎng)2 d.第4 d排空反應(yīng)器，加入新鮮廢水，反應(yīng)器設(shè)置為：進(jìn)水0.5 h，曝氣22 h，閑置1 h，排水0.5 h，每天換水2.5 L，運(yùn)行溫度(26±2)℃.定時(shí)取樣測(cè)定出水水質(zhì).

　　苯甲酸合成廢水M1成分(mg · L-1)：NH4NO3 400，KH2PO4 100，K2HPO4 30，MgSO4 200，NaCl 30，酵母粉100，葡萄糖 200，3，5-二硝基苯甲酸(3，5-DNBA)100~1000，pH= 7.0.

　　CODCr采用重鉻酸鉀法測(cè)定(國(guó)家環(huán)�？偩帧端�和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》編委會(huì)，2002);TOC采用總有機(jī)碳分析儀(島津TOC-4200)檢測(cè);3，5-二硝基苯甲酸含量采用分光光度計(jì)法測(cè)定(李蒙英，2007);生物膜量采用稱重法測(cè)定.

　　3 結(jié)果與討論

　　3.1 架橋細(xì)菌與土著菌和降解菌的共凝集

　　從采集的活性污泥中分離得到13株細(xì)菌，分別命名為L(zhǎng)2、L7、L7R、L8、L15、L25、L31、L47、L48、L51、L61、LF3、LH1，連同已有的3，5-二硝基苯甲酸降解菌A3、苯酚降解菌P1和甲基對(duì)硫磷降解菌DLL-1，分別與G5配對(duì)，對(duì)其共凝集能力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖 1所示.由圖 1可知，G5與16株細(xì)菌配對(duì)組合的共凝集率在2 h時(shí)達(dá)到40%~70%，能與56%(9株)的細(xì)菌發(fā)生共凝集率大于50%的共凝集反應(yīng);20 h時(shí)，共凝集率可達(dá)55%~80%，同時(shí)能與高達(dá)93%(15株)的細(xì)菌發(fā)生共凝集率大于50%的共凝集反應(yīng).值得注意的是，G5與3種降解菌在20 h時(shí)的共凝集率分別可達(dá)到77.7%、59.1%和68.3%，表明在廢水處理系統(tǒng)外G5能與土著菌和降解菌發(fā)生較強(qiáng)程度的共凝集.

　　圖 1 G5與土著菌、降解菌混合培養(yǎng)不同時(shí)段的共凝集率

　　G5與3株降解菌孵育20 h時(shí)的凝集體見(jiàn)圖 2.G5菌體細(xì)胞顯著大于3株降解菌，從電鏡照片中可清晰觀測(cè)到G5分別與3株配對(duì)菌黏聯(lián)在一起，形成共凝集體，同時(shí)G5和降解菌自身也有自凝集現(xiàn)象，表明G5通過(guò)共凝集和自凝集形成了較大的菌團(tuán).

　　圖 2 G5與3株降解菌孵育20h時(shí)的凝集體

　　3.2 架橋細(xì)菌與土著菌和降解菌混合培養(yǎng)時(shí)的成膜能力

　　在營(yíng)養(yǎng)濃度高的LB培養(yǎng)液中，有93%(15/16)的細(xì)菌與G5混合培養(yǎng)時(shí)的生物膜形成量(以O(shè)D570表征)高于單菌培養(yǎng)的生物膜形成量，其中11株的成膜能力超過(guò)1.5(圖 3a).在營(yíng)養(yǎng)濃度較高的10%LB培養(yǎng)液中，88%(14/16)的細(xì)菌與G5混合培養(yǎng)時(shí)的生物膜形成量高于單菌培養(yǎng)的生物膜形成量，僅有8株成膜能力超過(guò)1.0(圖 3b).在營(yíng)養(yǎng)濃度較低的5%LB培養(yǎng)液中，雖然仍舊有高達(dá)93%的細(xì)菌與G5混合培養(yǎng)時(shí)的生物膜形成量高于單菌培養(yǎng)的生物膜量，但成膜能力普遍很低，平均只有0.6(圖 3c).

　　圖 3 不同培養(yǎng)基中G5與配對(duì)菌單獨(dú)培養(yǎng)及混合培養(yǎng)24 h時(shí)的生物膜形成量(a.LB，b. 10%LB，c. 5%LB)

　　無(wú)論單獨(dú)培養(yǎng)還是混合培養(yǎng)，生物膜量均隨著營(yíng)養(yǎng)濃度的降低而減少.同時(shí)，G5與16株細(xì)菌中的大多數(shù)細(xì)菌混合培養(yǎng)時(shí)均增加了生物膜形成量，表現(xiàn)出促進(jìn)生物膜形成的能力.由此可見(jiàn)，G5不僅具有廣泛的共凝集能力，還具有很強(qiáng)的成膜能力.SPSS分析結(jié)果顯示，G5與16株細(xì)菌的共凝集率與其成膜量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.896(p<0.01).如圖 1、圖 3所示，G5與3，5-二硝基苯甲酸降解菌A3的共凝集率為62.4%，混合培養(yǎng)時(shí)的成膜能力可達(dá)2.5;與苯酚降解菌P1的共凝集率為60.0%，成膜能力為1.8.

　　3.3 序批式生物膜反應(yīng)器(SBBR)運(yùn)行結(jié)果 3.3.1 反應(yīng)器的啟動(dòng)掛膜

　　由圖 4a可知，反應(yīng)器啟動(dòng)時(shí)3，5-二硝基苯甲酸(3，5-DNBA)初始濃度為100 mg · L-1.曝氣過(guò)程中活性污泥隨氣體懸浮并很快附著到填料上.悶曝24 h后，投加降解菌A3的2號(hào)和3號(hào)反應(yīng)器出水中3，5-DNBA含量分別下降至19.1 mg · L-1和10.1 mg · L-1，而未投加降解菌的對(duì)照組1號(hào)反應(yīng)器為89.3 mg · L-1，表明投加降解菌的2個(gè)反應(yīng)器能快速降解3，5-DNBA.第2 d，對(duì)照組1號(hào)反應(yīng)器出水中3，5-DNBA含量降至3.6 mg · L-1，說(shuō)明來(lái)自污水處理廠活性污泥中的混合菌群也對(duì)3，5-DNBA進(jìn)行了降解.

　　3.3.2 反應(yīng)器的長(zhǎng)期運(yùn)行

　　第4 d排空反應(yīng)器，以填料上快速形成的生物膜進(jìn)行廢水處理，運(yùn)行24 h時(shí)，1、2號(hào)和3號(hào)反應(yīng)器出水中3，5-DNBA含量分別降至37.6、7.4和7.3 mg · L-1(圖 4a).表明排空污泥后，2號(hào)和3號(hào)反應(yīng)器中生物膜對(duì)底物具有快速降解能力，明顯高于未投加降解菌A3的1號(hào)反應(yīng)器.

　　圖 4 反應(yīng)器出水中3，5-二硝基苯甲酸、COD和TOC含量

　　運(yùn)行至第13 d，提高進(jìn)水中的3，5-DNBA至200 mg · L-1，14 d時(shí)對(duì)照組1號(hào)反應(yīng)器與只投加了A3菌的2號(hào)反應(yīng)器出水3，5-DNBA含量由13 d時(shí)的20.2 mg · L-1和20.4 mg · L-1分別升至111.7 mg · L-1和107.1 mg · L-1;保持此負(fù)荷運(yùn)行1周后，兩個(gè)反應(yīng)器出水3，5-DNBA含量均穩(wěn)定在110~120 mg · L-1之間，3，5-DNBA平均降解率分別為34.7%和43.0%，與最初2周的去除率相比有較大幅度下降，表明進(jìn)水3，5-DNBA濃度的增加使其受到較大沖擊.而在投加A3和G5的3號(hào)反應(yīng)器，14 d時(shí)出水3，5-DNBA含量?jī)H為3.0 mg · L-1，3，5-DNBA平均降解率為74.1%，說(shuō)明進(jìn)水負(fù)荷的加大對(duì)反應(yīng)器的沖擊較小，保持了穩(wěn)定的生物強(qiáng)化效果.

　　由于3個(gè)反應(yīng)器中底物均可較快速的降解，運(yùn)行后期快速提升底物負(fù)荷，30 d時(shí)3.5-DNBA含量達(dá)1000 mg · L-1.1號(hào)與2號(hào)反應(yīng)器出水中3，5-DNBA含量出現(xiàn)小幅增加，但降解率仍呈現(xiàn)交替上升，最終分別為87.9%和88.1%，兩者降解能力相差不大.3號(hào)反應(yīng)器降解率只出現(xiàn)輕微波動(dòng)，經(jīng)過(guò)短暫調(diào)整后3，5-DNBA降解率最終達(dá)到88.1%，運(yùn)行過(guò)程中降解率和穩(wěn)定性總體上高于1號(hào)和2號(hào)反應(yīng)器.3個(gè)反應(yīng)器對(duì)COD、TOC的去除效果表現(xiàn)出與3，5-DNBA相似的變化趨勢(shì)(圖 4b、4c).

　　從活性污泥中分離獲得的土著菌均不能單獨(dú)降解3，5-DNBA，反應(yīng)器運(yùn)行結(jié)果顯示，未添加降解菌的1號(hào)反應(yīng)器也能較好地降解3，5-DNBA，推測(cè)污泥中的混合菌群可能通過(guò)共代謝、協(xié)同作用等方式使復(fù)雜有機(jī)物3，5-DNBA得到了降解.2號(hào)反應(yīng)器24 h內(nèi)對(duì)3，5-DNBA的快速降解則體現(xiàn)了降解菌A3本身良好的生物強(qiáng)化效果.投加混合菌劑的3號(hào)反應(yīng)器保持了較穩(wěn)定的3，5-DNBA降解能力，一定程度上說(shuō)明G5促進(jìn)了A3在生物膜中的定殖和生長(zhǎng)，從而能夠長(zhǎng)期維持良好的降解效果和較強(qiáng)的抗沖擊負(fù)荷能力.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3.3.3 生物膜量

　　圖 5顯示了運(yùn)行前、中、后期3個(gè)反應(yīng)器內(nèi)生物膜量的變化.由圖可知，運(yùn)行前20 d，1號(hào)和2號(hào)反應(yīng)器內(nèi)生物膜量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，運(yùn)行后期膜量下降，表明有一定的脫落.投加混合菌種的3號(hào)反應(yīng)器內(nèi)，運(yùn)行后期生物膜量仍保持增長(zhǎng)，其并未因沖刷引起膜量過(guò)多脫落而導(dǎo)致減少.

　　圖 5 反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程中生物膜量

　　4 結(jié)論

　　1)G5與13株土著菌和3株降解菌兩兩配對(duì)組合的共凝集率結(jié)果顯示，孵育2 h和20 h時(shí)，G5分別能與9株(占總測(cè)定菌株的56%)和15株(占總測(cè)定菌株的93%)細(xì)菌發(fā)生共凝集率大于50%的共凝集，共凝集率可達(dá)40%~70%和55%~80%，表現(xiàn)出廣泛的共凝集能力.

　　2)不同營(yíng)養(yǎng)條件下，90%配對(duì)菌與G5混合培養(yǎng)的生物膜形成量高于單菌培養(yǎng)，表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)生物膜形成的能力.

　　3)同時(shí)投加降解菌A3與架橋細(xì)菌G5的序批式反應(yīng)器表現(xiàn)出快速的生物強(qiáng)化作用和較強(qiáng)的抗沖擊能力，并保持了較高的生物膜量，說(shuō)明在廢水處理系統(tǒng)內(nèi)，Bacillus cereus G5亦可能通過(guò)其廣泛的共凝集能力促進(jìn)生物膜的形成，并輔助降解菌以自固定化方式定殖于生物膜中.