微生物燃料電池剛果紅同步脫色和產(chǎn)電性能研究

　　1 引言

　　微生物燃料電池(Microbial fuel cell，MFC)能在降解有機(jī)污染物的同時產(chǎn)生電能，是一種新概念的廢水處理方法(Logan et al., 2006a;2009).其原理為：陽極微生物厭氧氧化有機(jī)物獲取電子，并將電子傳遞給陽極，再通過外電路傳遞給陰極電子受體(如氧氣)，同時伴隨著質(zhì)子由陽極到陰極的跨膜擴(kuò)散(Logan et al., 2006b).

　　陽極微生物是影響MFC產(chǎn)電和降解性能的關(guān)鍵因素(Logan et al., 2008).宋天順等(2012)以氨氮模擬廢水為底物，分別以厭氧污泥和河底沉積物接種單室MFC陽極，研究發(fā)現(xiàn)，厭氧污泥接種的MFC的最大功率密度比沉積物接種的MFC大46.8%，但氨氮去除率卻低3.8%.王慧勇等(2012)以模擬淀粉廢水為底物，比較了分別接種生活污水和淀粉廢水的MFC的性能，發(fā)現(xiàn)接種生活污水的MFC的最大功率密度比接種淀粉廢水的高141.3%，氨氮去除率高2.7%. Li等(2013)以廚余浸出液為底物，發(fā)現(xiàn)以厭氧污泥為接種源的MFC的最大功率密度比以生活污水為接種源的MFC低1.8%，但VFA去除率高5.5%;PCR-DGGE分析發(fā)現(xiàn)二者的優(yōu)勢菌種存在顯著差異.可見，在相同的MFC構(gòu)型和環(huán)境條件下，接種源的微生物多樣性與基質(zhì)的特異性決定了MFC陽極微生物種群結(jié)構(gòu)(Logan et al., 2006b;Pham et al., 2009)，從而可能影響了MFC的產(chǎn)電和降解性能(Aelterman et al., 2006).

　　理論上，在易降解有機(jī)物-難降解有機(jī)物共基質(zhì)體系中可馴化出能適應(yīng)難降解有機(jī)物的菌種，基質(zhì)的選擇性壓力(Logan et al., 2006b)會改變MFC陽極最初的微生物群落結(jié)構(gòu)，富集出適應(yīng)于代謝基質(zhì)的優(yōu)勢菌群(Logan，2009; Yang et al., 2012).因此，在課題組前期研究的基礎(chǔ)上(Sun et al., 2009a;2009b;Cao et al., 2010;Hou et al., 2011;Sun et al., 2011;2012)，為明確接種源對MFC同步降解剛果紅和產(chǎn)電的影響規(guī)律，本研究以葡萄糖-剛果紅為共基質(zhì)，以印染廢水和生活污水處理系統(tǒng)中的污泥為接種源，探究兩種接種源MFC同步降解剛果紅和產(chǎn)電性能情況;并通過分析陽極生物膜電化學(xué)特性，分離并鑒定穩(wěn)定運行下的MFC陽極優(yōu)勢菌種，闡明兩種接種源MFC陽極優(yōu)勢菌種差異與降解剛果紅和產(chǎn)電性能之間的關(guān)系，為基于接種源調(diào)控的MFC降解難降解有機(jī)物和產(chǎn)電提供借鑒.

　　2 材料與方法

　　2.1 試劑

　　剛果紅(C32H22N6O6S2Na2，分析純)，購于天津大茂化學(xué)試劑廠，使用前未經(jīng)純化處理.

　　2.2 反應(yīng)器及其接種與運行

　　采用好氧生物陰極雙室MFC反應(yīng)器(Hou et al., 2012)，取廣州市獵德污水處理廠和新洲工業(yè)園某印染廢水處理站的厭氧污泥各10 mL，混合后分別作為MFC-M和MFC-I(M、I分別為Municipal、Industrial的縮寫)陽極的接種源，接種濃度為2.0 g · L-1(以MLSS計).從馴化到穩(wěn)定運行階段，兩個反應(yīng)器陽極室培養(yǎng)液的組成均保持一致：剛果紅300 mg · L-1、葡萄糖200 mg · L-1、PBS 50 mmol · L-1、微量元素溶液12.5 mL · L-1、維生素溶液12.5 mL · L-1(Lovley et al., 1988).陰極室培養(yǎng)液中不含剛果紅和葡萄糖，其他成分與陽極培養(yǎng)液相同.運行過程中，陰極室維持60 mL · min-1的曝氣量.采用批式運行，當(dāng)輸出電壓值低于50 mV時更換培養(yǎng)液.

　　2.3 電化學(xué)性能表征

　　電化學(xué)性能表征包括輸出電壓、庫倫效率、功率密度、陰陽極極化曲線、循環(huán)伏安和電化學(xué)阻抗譜.MFC的輸出電壓由數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(Model 2700，Keithly Instruments，USA)每10 min自動采集1次.功率密度和陰陽極極化曲線采用變電阻的方法在MFC經(jīng)過數(shù)周期運行穩(wěn)定后進(jìn)行同步測試，電極電勢測定所用參比電極為飽和甘汞電極(SCE，0.242 V vs. 標(biāo)準(zhǔn)氫電極，上海雷磁).單位面積電流密度、功率密度及庫倫效率的計算公式(Logan et al., 2006a)如下：

　　式中，I為單位面積電流密度(mA · cm-2)，U為外電路電壓(V)，R為電阻(Ω)，A為電極面積(cm2)，P為單位面積功率密度(mW · m-2)，F(xiàn)為法拉第常數(shù)(C · mol-1)，VAn為陽極室液體體積(cm3)，tb為周期時間(s)，ΔCOD為周期初與周期末的COD變化值(mg · L-1)，CE為庫倫效率.

　　循環(huán)伏安(CV)和電化學(xué)阻抗譜(EIS)的測定均在Princeton 2273型電化學(xué)工作站上進(jìn)行.當(dāng)MFC開路電壓達(dá)到穩(wěn)定時，采用三電極體系進(jìn)行測試，其中，工作電極為陽極，對電極為陰極，參比電極為飽和甘汞電極.循環(huán)伏安設(shè)置測試參數(shù)：掃描范圍為-0.7~1.2 V，掃描速率為10 mV · s-1.電化學(xué)阻抗譜設(shè)置測試參數(shù)：頻率范圍為100 kHz~5 mHz，交流電壓振幅為10 mV.

　　2.4 剛果紅脫色性能表征

　　剛果紅(初始濃度300 mg · L-1)脫色率由紫外可見光分光光度計(DR5000，HACH，USA)在其最大波長(496 nm)下測定吸光度的減少值計算得到.在48 h內(nèi)每隔6 h從MFC陽極中取樣，稀釋后測定吸光度.脫色率η可由下式計算得到：

　　式中，A為初始吸光度，B為測試樣品吸光度.

　　脫色速率可由脫色率-時間曲線推算得出，由于脫色率隨時間增加會先呈現(xiàn)線性上升，在一定時間后脫色速率明顯降低、脫色率趨于穩(wěn)定，為簡化計算，平均脫色速率將直接采用近似線性部分的斜率進(jìn)行計算，具體公式為

　　式中，S為脫色速率(mg · L-1 · h-1)，C0為剛果紅初始濃度(mg · L-1)，t為線性部分終點時間，η為該時間點對應(yīng)的脫色率.

　　采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS，6890 N/5973 inert，Agilent Technologies，USA)對MFC周期末的陽極室降解液進(jìn)行產(chǎn)物分析.樣品處理及分析條件參考文獻(xiàn)(廖梅東等，2010).

　　2.5 優(yōu)勢菌種的分離、純化與鑒定

　　采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nutrient agar，NA)(pH=7.0)作為純菌分離、純化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基.在厭氧培養(yǎng)箱中，從穩(wěn)定運行6個月以上的MFC-I和MFC-M的陽極生物膜上刮下少許，用無菌去離子水稀釋到10-6倍后涂布平板，在(30±1)℃下的NA培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h.用新鮮的無菌NA培養(yǎng)基進(jìn)行重復(fù)轉(zhuǎn)移和純化，直到獲得純培養(yǎng)菌株.采用LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(pH=7.0)作為富集純培養(yǎng)菌株的基礎(chǔ)培養(yǎng)基.所用培養(yǎng)基均通過多次抽真空和通氮氣以確保去除其中的氧氣.菌種委托寶生物工程(大連)有限公司采用16S rRNA基因序列進(jìn)行鑒定，使用BigDye�i Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit在ABI-PRISMTM 3730XL DNA測序儀上進(jìn)行分析，在NCBI上的BLAST-n進(jìn)行比對(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分析核苷酸序列.

　　3 結(jié)果與討論

　　3.1 兩種接種源MFC的啟動特點

　　在外接1000 Ω電阻的條件下，兩種接種源接種的MFC的輸出電壓隨時間的變化如圖 1所示.在接種后約800 h內(nèi)(啟動階段)，MFC-I和MFC-M的輸出電壓均表現(xiàn)出波動上升趨勢，但MFC-I的輸出電壓略高于MFC-M.進(jìn)入穩(wěn)定運行階段后，MFC-I和MFC-M的輸出電壓差別不大.

　　導(dǎo)致兩種接種源MFC啟動初期電壓差別的原因在于剛果紅對微生物的選擇性壓力.印染廢水污泥中微生物長期經(jīng)染料馴化，對剛果紅的適應(yīng)性強(qiáng)，來自剛果紅的選擇性壓力較小;而生活污水污泥中的微生物首次接觸剛果紅，對剛果紅的適應(yīng)性較差，來自剛果紅的選擇性壓力較大.但經(jīng)過一定時間的馴化后，生活污水污泥中的微生物對剛果紅的適應(yīng)性增強(qiáng)，剛果紅的選擇性壓力減弱，從而使兩種接種源MFC穩(wěn)定運行時的輸出電壓相當(dāng).

圖 1 兩種接種源MFC輸出電壓-時間曲線

　　3.2 兩種接種源MFC的產(chǎn)電性能

　　特定外電阻下的輸出電壓-時間曲線并不足以從整體描述MFC的產(chǎn)電性能.為探究不同外電阻下MFC-I和MFC-M產(chǎn)電性能的差異，采用變電阻法測試了兩個反應(yīng)器的功率密度和極化曲線.如圖 2a所示，穩(wěn)定運行階段MFC-M的最大功率密度達(dá)到29.09 mW · m-2，比MFC-I高出2.11倍.陰、陽極極化曲線測定結(jié)果表明，二者功率密度差異是由陽極導(dǎo)致(圖 2b).MFC-I陽極開路電勢較MFC-M的高，且隨著電流密度從0增加到0.015 mA · cm-2，MFC-I陽極電勢較MFC-M的抬升幅度更高，表明在相同電流密度下，以印染廢水污泥接種的MFC-I對剛果紅-葡萄糖共基質(zhì)的生物電化學(xué)氧化需要更大的驅(qū)動力(即能量需求更大)，陽極過電勢越大，這與功率密度測定的結(jié)果一致.選擇運行1400 h后的3個穩(wěn)定周期進(jìn)行庫倫效率的測定與計算，結(jié)果表明，MFC-M的庫倫效率(即電子的回收率)較高，達(dá)31.89%;而MFC-I的庫倫效率較低，為29.03%.

圖 2 穩(wěn)定運行階段MFC-I和MFC-M的功率密度(a)與陰、陽極極化曲線(b)

　　生活污水污泥接種的MFC-M產(chǎn)電性能更好，主要原因在于生活污水成分復(fù)雜，其污泥中微生物多樣性豐富，包含的產(chǎn)電菌較多(Logan，2009;Yang et al., 2012);而印染廢水污泥在染料的長期馴化下微生物種群相對單一，染料降解菌較多.此外，剛果紅的降解與產(chǎn)電是電子競爭過程，相對于陽極，剛果紅優(yōu)先獲得電子(Sun et al., 2012)，MFC-I中較多的染料降解菌能競爭到更多的電子用于染料脫色，導(dǎo)致傳遞給陽極的電子減少，陽極極化明顯.

　　3.3 兩種接種源MFC陽極剛果紅的降解速率和降解產(chǎn)物分析

　　穩(wěn)定運行階段，MFC-I和MFC-M對剛果紅的脫色率隨時間變化如圖 3所示.在運行周期初的12 h內(nèi)，MFC-I(16.24 mg · L-1 · h-1)的平均脫色速率比MFC-M(13.50 mg · L-1 · h-1)高20.3%;12 h后脫色速率均明顯降低，MFC-I(4.69 mg · L-1 · h-1)的平均脫色速率比MFC-M(4.10 mg · L-1 · h-1)高14.4%;在48 h內(nèi)，MFC-I在任一時間點對剛果紅的脫色率均比MFC-M高出4%~20%.這是由于印染廢水污泥在染料的長期馴化下微生物多樣性相對單一，其功能傾向于優(yōu)先降解染料;結(jié)合產(chǎn)電性能比較，可從側(cè)面驗證了因剛果紅降解與產(chǎn)電爭奪電子導(dǎo)致的產(chǎn)電性能差異.48 h后，MFC-M和MFC-I對剛果紅的脫色率均達(dá)到90%以上，說明在剛果紅的長期馴化后，兩種接種源對反應(yīng)器的最終脫色率差異不大.

圖 3 穩(wěn)定運行階段兩種接種源MFC對剛果紅的脫色率-時間曲線

　　兩種接種源MFC陽極的剛果紅脫色產(chǎn)物分析如圖 4和圖 5所示.從色譜峰的出峰時間和峰強(qiáng)度來看，MFC-I和MFC-M中剛果紅脫色產(chǎn)物相同且濃度相當(dāng)，主要有3種物質(zhì)：2-氨基-1，4-萘醌(15.394 min)、2，2′-二氨基聯(lián)苯(16.345 min)、4，4′-二氨基聯(lián)苯(也稱為聯(lián)苯胺，17.861 min)，這與孫健等的研究結(jié)果一致(Sun et al., 2012).這說明在剛果紅-葡萄糖共基質(zhì)環(huán)境下長期運行，兩種接種源MFC對剛果紅的降解產(chǎn)物和降解效率差異很小.

圖 4 穩(wěn)定運行階段周期末MFC-I(a)和MFC-M(b)陽極脫色產(chǎn)物氣相色譜圖

圖 5 穩(wěn)定運行階段周期末MFC-I和MFC-M陽極脫色產(chǎn)物質(zhì)譜圖(a.2-氨基-1，4-萘醌，b.2，2′-二氨基聯(lián)苯，c.聯(lián)苯胺)

　　3.4 生物膜電化學(xué)特性

　　CV被廣泛用于研究MFC中細(xì)菌與電極表面的電化學(xué)交互作用機(jī)制(Rabaey et al., 2004;2005;Marsili et al., 2008).為了探究長期運行下，兩種接種源MFC陽極生物膜與電極表面之間的電化學(xué)反應(yīng)特性差異，對穩(wěn)定運行階段最大輸出電壓時和周期末(電壓低于10 mV，基質(zhì)幾乎消耗完全)的MFC陽極進(jìn)行了CV掃描.

　　如圖 6a所示，最大輸出電壓下，MFC-I和MFC-M陽極的CV中均呈現(xiàn)出一對明顯的氧化還原峰，分別為-0.41 V的氧化峰和0.52 V的還原峰(MFC-M)，以及為-0.31 V的氧化峰和0.66 V的還原峰(MFC-I)，但MFC-I氧化還原峰的位置均比MFC-M有些許偏移.這說明二者陽極表面發(fā)生氧化還原化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)不同，可能是兩種接種源生物膜中微生物種群的差異所致(Marsili et al., 2008).同時，由圖 6a可看出，MFC-M的氧化還原峰面積及峰高均明顯大于MFC-I，說明MFC-M生物膜具有更高的電化學(xué)活性(Carmona-Martinez et al., 2011).由圖 6b可以看出，與最大電壓下(圖 6a)的CV圖相比，周期末CV圖的氧化還原峰的峰高明顯減小，這是共基質(zhì)耗盡的結(jié)果.此外，氧化還原特征峰發(fā)生了不同程度的偏移，參考Rabaey等(2004)的研究，推測是剛果紅脫色產(chǎn)物在陽極表面進(jìn)一步氧化降解所致.

圖 6 穩(wěn)定運行階段最大電壓時(a)和周期末(b)MFC-I和MFC-M陽極的循環(huán)伏安曲線

　　CV和GC-MS檢測發(fā)現(xiàn)，在MFC-M和MFC-I 周期末CV圖中，電壓約為0.747 V時，均出現(xiàn)了峰電流約為16.3 mA的還原峰，其標(biāo)準(zhǔn)還原電位約為-0.201 V;結(jié)合GC-MS分析結(jié)果推測該峰為生物膜細(xì)菌產(chǎn)生的電子氧化還原介體之一的2-氨基—1，4-萘醌的特征峰(Rau et al., 2002;Fultz et al., 1982).2-氨基—1，4-萘醌的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位高于細(xì)胞脫氫酶NDAH的氧化還原電位值(-0.320 V，Rau et al., 2002)，但低于陽極電勢(約為-0.100 V)和剛果紅標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電勢(+0.102 V)，說明2-氨基-1，4-萘醌可作為電子介體協(xié)助電子由細(xì)胞到陽極和剛果紅分子的傳遞.其次，至今發(fā)現(xiàn)的醌類電子介體及其標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位已有2-氨基—3-羧基—1，4-萘醌(-0.071 V)、2-羥基—1，4-萘醌(-0.137 V)、1，2-萘醌(+0.135 V)、1，2-萘醌—4-磺酸(+0.217 V)(Yamazaki et al., 1999;Rau et al., 2002;Fultz et al., 1982;dos Santos et al., 2007)，產(chǎn)物中擁有萘醌結(jié)構(gòu)的2-氨基—1，4-萘醌的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位約為-0.201 V，與其他醌類電子介體的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位相近.最后，根據(jù)Nortemann等(1994)的研究發(fā)現(xiàn)，醌類電子介體是在Pseudomonas sp. BN6降解萘磺酸鹽的過程中由微生物代謝得到的.剛果紅與萘磺酸鹽同樣有醌類基團(tuán)，且陽極優(yōu)勢菌種也以Pseudomonas sp.為主(見3.5節(jié)).由此推斷，Pseudomonas sp.在代謝剛果紅的過程中，使其斷鍵生成2-氨基—1，4-萘醌，而2-氨基—1，4-萘醌作為電子介體可進(jìn)一步促進(jìn)氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行.

　　采用EIS測定了兩種接種源MFC陽極在最大電壓時的阻抗，其能斯特曲線如圖 7所示，阻抗分析見表 1.圖 7中，曲線高頻部分與X軸的交點對應(yīng)值為歐姆阻抗Rs，從高頻到低頻得到半圓的擬合直徑為極化阻抗Rct.由表 1可看出，MFC-I和MFC-M陽極的Rs和Rd均較小(約3~5 Ω)，因此，陽極阻抗主要由表征電子傳遞速率的極化阻抗Rct導(dǎo)致.如圖 7和表 1所示，在輸出電壓最大時，MFC-M陽極Rct比MFC-I陽極低38.0%，說明MFC-I的陽極電子供應(yīng)不足或電子傳遞阻力較大，這與測得的陽極極化曲線一致.因為MFC-I中染料脫色菌較多，加速了剛果紅脫色，消耗了大量來自共基質(zhì)葡萄糖的電子，致使傳遞給陽極的電子急劇減少.

圖 7 最大電壓時MFC-I和MFC-M陽極的能斯特曲線(Zre為阻抗Z的實部，Zim為阻抗Z的虛部)

 表1 穩(wěn)定運行階段最大電壓時MFC-I和MFC-M陽極的內(nèi)阻分析

 　　3.5 兩種接種源的MFC陽極優(yōu)勢菌種分析

　　從MFC-M和MFC-I陽極各分離出3株純菌，分別命名為M-P、M-P2、M-B和I-P、I-P2、I-A，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 8所示.由圖可知，MFC-M的優(yōu)勢菌為Pseudomonas sp.(M-P、M-P2)和Bacillus sp.(M-B);MFC-I的優(yōu)勢菌為Pseudomonas sp.(I-P、I-P2)和Aquamicrobium sp(I-A).其中，I-P和M-P、I-P2和M-P2、I-P和I-P2、M-P和M-P2、I-A和I-P、I-A和M-B、M-B和M-P的同源相似性分別為100%、99%、99%、99%、83%、81%、80%.可見，在一定的環(huán)境條件下，接種源微生物多樣性與特征基質(zhì)決定了MFC陽極優(yōu)勢菌種.

圖 8 MFC-I和MFC-M陽極生物膜上優(yōu)勢菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹

　　在同步降解剛果紅與產(chǎn)電MFC中的微生物一般可分為兩種：①產(chǎn)電菌，主要負(fù)責(zé)傳遞電子到電極;②剛果紅降解菌，主要負(fù)責(zé)降解剛果紅及其脫色產(chǎn)物(Sun et al., 2012).Pseudomonas sp.和Bacillus sp.均為最常見的產(chǎn)電菌屬.其中，Pseudomonas sp.能分泌電子介體(如綠膿菌素)，加速電子由細(xì)胞表面到陽極表面的傳遞，并且這類生物型電子介體還可被其他細(xì)菌利用，進(jìn)行種間電子傳遞，增大MFC輸出功率(Rabaey et al., 2004，2005;Logan et al., 2009).而Bacillus sp.在MFC中主要借助溶解性電子介體傳遞電子(Nimje et al., 2009).同時，Pseudomonas sp.和Bacillus sp.也是常見的染料降解菌(Cervantes et al., 2011;Jain et al., 2012).故可以判斷MFC-M在產(chǎn)電和剛果紅降解方面的高效性能歸功于同為產(chǎn)電菌和染料降解菌的優(yōu)勢菌種Pseudomonas sp.和Bacillus sp..從圖 8中可以看出，在MFC-I中也分離出了與MFC-M中同源性較高的Pseudomonas sp..此外，關(guān)于Aquamicrobium sp.雖然在MFC領(lǐng)域中的應(yīng)用雖然鮮有報道，但已發(fā)現(xiàn)其能夠代謝雜環(huán)化合物噻吩-2-甲酸叔丁酯(Bambaue et al., 1998)、聯(lián)苯和聚氯聯(lián)苯(Chang et al., 2013)，因此，極有可能具有降解剛果紅的能力.具體參見污水寶商城資料或http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　綜上分析可以初步判斷，兩種接種源MFC陽極均存在產(chǎn)電菌和剛果紅降解菌，但由于各優(yōu)勢菌屬的剛果紅降解與產(chǎn)電途徑和能力的差異，從而導(dǎo)致了二者在同步降解剛果紅與產(chǎn)電過程中功率密度、剛果紅脫色速率和生物膜電化學(xué)活性的差異.

　　1)分別以印染廢水污泥和生活污水污泥接種MFC，研究發(fā)現(xiàn)，接種源會影響MFC的產(chǎn)電性能.啟動階段，MFC-I的輸出電壓高于MFC-M;但穩(wěn)定運行階段，二者最大輸出電壓差別不大.穩(wěn)定運行階段MFC-M最大功率密度比MFC-I高2.11倍，陽極Rct比MFC-I低38.0%，生物膜電化學(xué)活性更強(qiáng).

　　2)接種源同時會影響MFC對剛果紅的脫色性能，但對剛果紅的降解產(chǎn)物沒有影響.MFC-I對剛果紅的脫色速率比MFC-M高14.4%~20.3%，主要降解產(chǎn)物均為2-氨基—1，4-萘醌、2，2′-二氨基聯(lián)苯、4，4′-二氨基聯(lián)苯.

　　3)接種源還會導(dǎo)致MFC陽極優(yōu)勢菌種的差異.二者均存在Pseudomonas sp.，但MFC-M陽極還存在優(yōu)勢菌Bacillus sp.，而MFC-I的陽極還存在優(yōu)勢菌Aquamicrobium sp.