1 引言
柴油是土壤和水體中常見(jiàn)的一種污染物，由于其疏水性強(qiáng)，不活潑且難生物降解，會(huì)在環(huán)境中長(zhǎng)期滯留，進(jìn)而危害水體功能和水生生物資源，因此，柴油廢水的治理一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn).
目前，治理柴油污染的方法主要有物理法、化學(xué)法、生物法等.物理和化學(xué)法能夠快速去除柴油大部分組分，但成本較高且易引起二次污染. 而微生物法具有成本低、操作簡(jiǎn)單和可避免二次污染等優(yōu)點(diǎn)，因此，微生物修復(fù)環(huán)境中柴油污染具有很大的潛力和優(yōu)勢(shì).
在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，游離菌表現(xiàn)出單位體積內(nèi)有效降解菌濃度低和抗毒性侵害能力差的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響其降解效果(Liu et al.，2009). 固定化技術(shù)可克服細(xì)胞太小且與水溶液分離困難、易造成二次污染等弊端，具有菌體密度高、反應(yīng)迅速及菌體流失少等優(yōu)勢(shì)，是一種具有巨大應(yīng)用前景的污染物處理技術(shù).
近年來(lái)，關(guān)于固定化技術(shù)在石油烴降解領(lǐng)域的應(yīng)用受到越來(lái)越多的關(guān)注.Lin等(2014)將兩株降解菌固定在棉纖維上來(lái)降解粗油，發(fā)現(xiàn)當(dāng)鹽度低于70 g · L-1時(shí)，相比游離菌，固定化菌對(duì)原油的去除效果提升了30%.Costa等(2014)利用殼聚糖小球固定化B. pumilus UFPEDA831，發(fā)現(xiàn)固定化菌體對(duì)碳?xì)浠衔锶コ蔬_(dá)90.8%，并且可以回收利用.目前，絕大多數(shù)固定化技術(shù)研究關(guān)注的焦點(diǎn)是降解的影響因素，如pH、鹽度和溫度等，而關(guān)于固定化微生物的對(duì)柴油去除機(jī)理，即對(duì)先利用固定化材料對(duì)廢水 中的柴油進(jìn)行吸附，然后被固定在載體上的微生物降解的研究鮮見(jiàn)報(bào)道.
因此，本試驗(yàn)以課題組前期篩選獲得的威尼斯不動(dòng)桿菌為研究菌種，以廉價(jià)易得的改性竹炭作為固定化載體，比較游離菌和固定化菌體對(duì)于一定濃度柴油溶液的去除效果，探討固定化菌吸附協(xié)同降解去除柴油的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，并借助紅外光譜(FTIR)、掃描電鏡(SEM)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)等表征手段，對(duì)比分析降解前后溶液的成分變化，為固定化菌降解柴油的機(jī)理研究提供研究基礎(chǔ)與理論依據(jù).
2 材料與方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 試劑
供試柴油為商用0#柴油(密度 0.84 kg · L-1)，經(jīng)高壓滅菌后，室溫下保存使用. 實(shí)驗(yàn)所用竹炭購(gòu)自福州某市場(chǎng)，具體參數(shù)如下：比表面積130.5 m2 · g-1，微孔容積0.059 cm3 · g-1，平均微孔徑1.79 nm.
改性竹炭顆粒的制備：先將竹炭顆粒用蒸餾水清洗3次，去除粉塵和殘留物，再置于105 ℃烘箱中6 h烘至恒重，過(guò)30~40目篩，最后放入600 ℃馬福爐中煅燒2 h，冷卻后置于干燥器內(nèi)備用.
2.1.2 菌種與培養(yǎng)基
菌種為本課題組實(shí)驗(yàn)室前期從福建某煉油廠篩選分離的威尼斯不動(dòng)桿菌(Acinetobacter venetianus)，其最佳降解條件為：溫度 30 ℃，氮源(NH4NO3)0.1 g · L-1，pH=7.0.
無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：K2HPO4 1 g，KH2PO4 1 g，NH4NO3 1 g，MgSO4 0.3 g，CaCl2 0.03 g，F(xiàn)eSO4 0.005 g，ZnSO4 0.002 g，MnSO4 0.0002 g，蒸餾水1 L，pH值為7.0.Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 L.以上所有培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃滅菌20 min后使用，微量元素于滅菌前加入.柴油培養(yǎng)基：無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，十四烷50 mg · L-1.
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 菌液的制備
從固體培養(yǎng)基斜面上挑取一環(huán)菌落，接種到10 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h.再按1%(體積比)的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h.將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，6000 r · min-1離心5 min，棄去上清液，再用無(wú)菌水沖洗離心，如此重復(fù)3次，加入無(wú)菌水調(diào)到波長(zhǎng)600 nm處OD600值為0.7的菌懸液備用.
2.2.2 固定化菌體的制備
稱取0.5 g改性竹炭顆粒，經(jīng)高溫滅菌后加入到含15 mL無(wú)機(jī)培養(yǎng)基的50 mL錐形瓶中，再按1.5%體積比加入菌液，于30 ℃、150 r · min-1恒溫振蕩箱中培養(yǎng)1 d，直到菌株固定在竹炭顆粒上. 固定化后的竹炭顆粒用無(wú)菌水沖洗3次去除表面的游離菌，制得改性竹炭固定化Acinetobacter venetianus(Liu et al.，2012).
2.2.3 柴油去除實(shí)驗(yàn)
將固定化菌體過(guò)濾后，加入到50 mL含柴油濃度為100 mg · L-1的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，放于恒溫振蕩箱，30 ℃、150 r · min-1下避光培養(yǎng)，分別在0、12、24、36 、48、60、72、84、96 h時(shí)取樣測(cè)定培養(yǎng)基中柴油的殘留量.分別以游離菌和改性竹炭作為對(duì)照，每個(gè)處理平行3次.
2.2.4 固定化菌體對(duì)不同濃度柴油的去除及吸附-降解動(dòng)力學(xué)分析
設(shè)置3組柴油濃度培養(yǎng)基，分別為80、120、140 mg · L-1.加入0.5 g固定化菌體，在30 ℃、150 r · min-1下于恒溫振蕩箱中避光培養(yǎng)，分別在0、12、24、36、48、60、72、84、96 h取樣測(cè)定溶液中柴油濃度，每個(gè)處理重復(fù)3次. 柴油的吸附量(Q)的計(jì)算公式如下：
式中，C0為柴油的初始濃度(mg · L-1)，Ct為反應(yīng)時(shí)間為t時(shí)溶液中殘余的柴油濃度(mg · L-1)，V是溶液體積(L)，M是改性竹炭顆粒的質(zhì)量(g).
2.2.5 柴油及其降解產(chǎn)物分析
培養(yǎng)基中柴油含量分析步驟如下，向培養(yǎng)基、錐形瓶各加入10 mL正己烷作為萃取劑，手動(dòng)萃取5 min，靜置10 min移取上清液，利用UV-Vis在波長(zhǎng)226.5 nm處測(cè)定吸光度，外標(biāo)法定量柴油濃度.
柴油降解產(chǎn)物分析采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，樣品的提取按照Vieira等(2007)報(bào)道的方法.以正己烷萃取反應(yīng)前后含柴油的水溶液，振蕩5 min，再添加定量的無(wú)水硫酸鈉充分吸水，最后取適量裝瓶測(cè)樣，分別對(duì)反應(yīng)前后溶液的去除效果進(jìn)行分析.本研究采用的儀器是GC-MS(Agilent 6890-5975，美國(guó))：DB-5石英毛細(xì)管柱(30 m×0. 25 mm×0. 25 μm);載氣為He;流速為1 mL · min-1;柱溫 60 ℃，恒溫2 min，以12 ℃ · min-1升溫至300 ℃，恒溫5 min;進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度300 ℃，總運(yùn)行時(shí)間27 min(Morris et al., 2009).
2.2.6 SEM樣品的制備與分析
取固定化菌體用無(wú)菌水洗滌3次，再使用2.5%戊二醛緩沖溶液(pH=7.2)浸泡0.5 h，用無(wú)菌水洗去殘余的戊二醛后，加入不同濃度的乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、90%和100%)逐級(jí)脫水，每個(gè)濃度脫水10 min，放入冷凍干燥器里干燥8 h. 再將制得的樣品固定在導(dǎo)電膠上，進(jìn)行等離子表面噴金. 采用日本Hitachi公司(型號(hào)為S-570)的掃描電子顯微鏡，觀察樣品表面的形貌與形態(tài)(Liu et al., 2012).
2.2.7 FTIR分析
含柴油水溶液處理前后的傅里葉變換紅外光譜采用美國(guó)Thermo Corp公司的Nicolet5700紅外光譜儀(波數(shù)范圍為400~4000 cm-1，4 cm-1的光譜分辨率)進(jìn)行分析，采用KBr法進(jìn)行制樣.
3 結(jié)果與討論
3.1 固定化菌對(duì)柴油的去除效果
圖 1為改性竹炭、固定化菌體與游離菌對(duì)柴油的去除情況. 從圖中可知，改性竹炭在96 h內(nèi)對(duì)柴油去除率達(dá)到22.6%，這表明改性竹炭對(duì)柴油具有一定的吸附效果，但吸附能力較弱. 游離菌對(duì)柴油去除率在96 h內(nèi)達(dá)到
80.50%，此去除過(guò)程依靠的是微生物的降解能力. 三者中，固定化菌的處理效率最高，在培養(yǎng)第96 h時(shí)對(duì)柴油去除率達(dá)到86.35%，該去除過(guò)程包含了竹炭吸附效果和微生物降解兩個(gè)途徑. 產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因一方面可能是由于改性竹炭具有表面多孔的特性，除了對(duì)柴油具有一定的吸附效果外，還為微生物的生長(zhǎng)提供了廣闊的空間，提高了細(xì)菌的密度，促進(jìn)了細(xì)菌對(duì)柴油的降解(Liu et al., 2012);另一方面，柴油中某些烴的組分經(jīng)過(guò)生物降解之后會(huì)產(chǎn)生一些對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制的產(chǎn)物，這些有毒產(chǎn)物的積累會(huì)影響微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，生物載體能夠有效地屏蔽毒性物質(zhì)對(duì)菌株的惡性侵害，增強(qiáng)其適應(yīng)性(汪杰等，2010).對(duì)于所有處理，降解速率在前24 h內(nèi)較快，之后開(kāi)始變緩，這可能是由于隨著微生物數(shù)量的急劇增長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗，微生物開(kāi)始衰亡，且柴油被分解后產(chǎn)生的一些物質(zhì)也會(huì)對(duì)其產(chǎn)生毒害作用，使降解率降低.
圖 1 游離菌、改性竹炭、固定化菌在96 h內(nèi)對(duì)柴油的去除效率
3.2 固定化菌對(duì)不同濃度柴油的去除
固定化菌對(duì)不同濃度柴油的去除如圖 2所示.從圖中可以看出，固定化菌對(duì)3種不同初始濃度的柴油的去除率隨時(shí)間的變化趨勢(shì)基本一致.實(shí)驗(yàn)前期由于水中柴油充分，微生物活性高，柴油的降解速率最快，8 h內(nèi)對(duì)3種濃度柴油的去除率超過(guò)80%. 隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，柴油作為碳源被大量消耗，培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物也逐漸減少，降解菌的生長(zhǎng)速率降低. 另外，降解產(chǎn)物的不斷積累對(duì)細(xì)菌的抑制作用也可能是去除率下降的一個(gè)影響因素(Wang et al., 2012). 培養(yǎng)96 h后，固定化菌對(duì)3種不同濃度的柴油的去除率分別達(dá)到84.8%(80 mg · L-1)、88.8%(120 mg · L-1)和90.5%(140 mg · L-1). 固定化菌對(duì)初始濃度為140 mg · L-1的柴油水溶液去除率要高于80 mg · L-1柴油水溶液，進(jìn)一步說(shuō)明固定化菌能夠以柴油作為碳源，進(jìn)而達(dá)到降解柴油的目的，同時(shí)表明固定化菌對(duì)高濃度柴油具有較強(qiáng)的耐受性.
圖 2 固定化菌在12 h內(nèi)對(duì)不同初始濃度的柴油的降解情況
3.3 吸附-降解動(dòng)力學(xué)分析
為了進(jìn)一步研究固定化菌對(duì)不同濃度(80、120、140 mg · L-1)柴油的去除機(jī)理，用偽一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型(2)(Lin et al., 2013)和偽二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型(3)(Lin et al., 2013)來(lái)擬合固定化菌降解柴油溶液12 h內(nèi)的吸附-降解動(dòng)力學(xué)，結(jié)果如表 1所示.
表 1 柴油在不同初始濃度下的降解動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果
式中，qt是t時(shí)柴油的去除量(mg · g-1)，qe是平衡時(shí)的柴油去除量(mg · g-1)，k1是偽一級(jí)動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)(min-1)，k2是偽二級(jí)動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)(g · mg-1 · min-1)，qe、k1和k2值都可以通過(guò)qt和t的圖表關(guān)系獲得.
動(dòng)力學(xué)擬合所得相關(guān)參數(shù)如表 1所示，在所有濃度柴油水溶液中，偽二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合效果(R2 >0.99)好于偽一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型(R2 <0.96). 當(dāng)柴油的含量分別為80、120和140 mg · L-1時(shí)，其對(duì)應(yīng)的去除速率常數(shù)k分別為0.1426、0.0993和0.0854 g · mg-1 · min-1，這一結(jié)果可以說(shuō)明柴油的初始含量越高，其去除速率越慢. 根據(jù)偽二級(jí)模型計(jì)算的不同濃度柴油的qe理論值(7.01、10.07、11.70 mg · g-1)更接近于實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值(6.739、10.304、12.637 mg · g-1). 結(jié)果表明，固定化菌去除柴油更符合偽二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，這說(shuō)明多個(gè)過(guò)程控制固定化菌體對(duì)柴油的去除.改性竹炭表面豐富的官能團(tuán)和內(nèi)部微孔的結(jié)構(gòu)，均對(duì)柴油吸附有所貢獻(xiàn).在柴油從水相向竹炭遷移的過(guò)程中，經(jīng)歷了水膜擴(kuò)散、竹炭顆粒表面擴(kuò)散和竹炭?jī)?nèi)部微孔擴(kuò)散等多種過(guò)程.柴油分子進(jìn)入改性竹炭載體后，負(fù)載在載體內(nèi)外的微生物將總石油烴作為碳源和能源物質(zhì)，在體內(nèi)外酶的作用下將其代謝分解(Wang et al., 2015).
根據(jù)上述的吸附-降解動(dòng)力學(xué)結(jié)果，提出一個(gè)可能的固定化菌吸附協(xié)同降解的過(guò)程機(jī)理，可分為兩個(gè)階段：在第一階段，固定化載體的吸附發(fā)揮主要作用，導(dǎo)致柴油的濃度降低;第二階段，固定化菌降解代謝起主導(dǎo)作用，這些假設(shè)將被后續(xù)的GC-MS及FTIR等分析手段進(jìn)一步證實(shí);最后階段，兩個(gè)過(guò)程的綜合作用使溶液里的柴油濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡.
3.4 SEM結(jié)果
固定前后的改性竹炭表面的SEM結(jié)果如圖 3所示. 從圖 3a可知，在固定化之前，改性竹炭表面積較大，且凹凸不平，分布著大小不一的微孔. 這種微孔結(jié)構(gòu)能夠保證氧氣、營(yíng)養(yǎng)元素的輸送及降解底物的排放. 這充分說(shuō)明改性竹炭是微生物固定化的理想載體，其所具有多孔結(jié)構(gòu)能夠?yàn)槲⑸锾峁┳銐虻纳L(zhǎng)空間. 此外，微孔結(jié)構(gòu)也可為污染物提供進(jìn)入載體內(nèi)部的通道(Wang et al., 2012). 從圖 3b可見(jiàn)，在孔狀結(jié)構(gòu)中有微生物生長(zhǎng)，且分布在改性竹炭載體上的菌落形態(tài)并不完全一致，有些細(xì)菌團(tuán)簇在一起，有些則處于分散狀態(tài). 由此說(shuō)明，竹炭固定細(xì)菌可能存在兩種途徑，包括菌體間的物理吸附及細(xì)菌與載體間的交聯(lián)作用(Qiao et al., 2010).
圖 3 改性竹炭固定化菌前(a)、后(b)的電鏡圖
3.5 FTIR結(jié)果
圖 4是固定化菌去除柴油水溶液前后的FTIR譜圖.由圖 4可知，降解前柴油水溶液的紅外譜圖中，3850~3500 cm-1范圍內(nèi)存在的3733.9 cm-1及3454.4 cm-1吸收峰，這是由強(qiáng)烈的羥基伸縮振動(dòng)引起的(Swiatkowski et al., 2004). 2970~2840 cm-1為飽和碳?xì)浠衔锏奶卣鞣澹导谆喖谆痛渭谆纳炜s振動(dòng)和彎曲振動(dòng)吸收峰.1572.1 cm-1處出現(xiàn)的強(qiáng)烈伸縮振動(dòng)峰為苯環(huán)骨架振動(dòng)產(chǎn)生(Cabal et al., 2009)，1470~1430 cm-1范圍內(nèi)的1448.6 cm-1吸收峰為C—CH3彎曲振動(dòng)峰，在1250~1150 cm-1區(qū)內(nèi)出現(xiàn)的1210 cm-1峰為支鏈烷烴的C—C骨架振動(dòng)吸收峰.柴油降解后紅外譜圖中，在3495~3430 cm-1出現(xiàn)的3437.2 cm-1峰為芳香仲胺的伸縮振動(dòng)峰，2924.4 cm-1附近的吸收峰為羧酸的特征峰，1410~1310 cm-1范圍內(nèi)的1407.8 cm-1峰為酯類(lèi)及醇類(lèi)的強(qiáng)烈伸縮振動(dòng)峰.比較降解前后的柴油水溶液的紅外圖譜發(fā)現(xiàn)，固定化菌體系能夠有效地處理柴油中的不同組分，經(jīng)反應(yīng)后，代謝產(chǎn)物中有羧酸類(lèi)、酯類(lèi)、醇類(lèi)等物質(zhì)產(chǎn)生.何良菊等(2004)研究表明，石油類(lèi)物質(zhì)在微生物的作用下，中間產(chǎn)物往往以脂肪酸類(lèi)物質(zhì)居多. 短鏈烷烴的亞末端氧化為醇和相應(yīng)的脂肪酸(Forney et al., 1968);直鏈烷烴的微生物降解途徑以單末端氧化和雙末端氧化生成二元羧酸為主(McKenna et al., 1970);發(fā)生單末端氧化時(shí)，烷烴氧化為相應(yīng)的醛和脂肪酸;而發(fā)生雙末端氧化，則是烷烴被轉(zhuǎn)化成二元羧酸(Scheller et al., 1998). 這表明柴油的降解過(guò)程中不僅有單末端氧化、次末端氧化，同時(shí)還有雙末端氧化.
圖 4 改性竹炭固定化菌前(a)、后(b)的電鏡圖
3.6 GC-MS分析結(jié)果
為了探究柴油的去除情況，分別對(duì)微生物降解前后的柴油水溶液進(jìn)行GC-MS分析. 圖 5分別是柴油、游離菌降解后及固定化菌去除后的GC-MS譜圖.從圖中可以看出，威尼斯不動(dòng)桿菌可以高效的降解柴油各種長(zhǎng)度的烷烴. 由圖 5b可知，經(jīng)過(guò)游離菌降解后，柴油中長(zhǎng)鏈烷烴(C16~C30)幾乎完全降解，對(duì)C11、C6、C8的降解率分別達(dá)到83.05%、59.54%、55.48%.烴類(lèi)的降解主要依賴于微生物的降解能力，又受烴類(lèi)自身性質(zhì)所制約.Liu等(2011)認(rèn)為飽和烴較不飽和烴更易降解，這就使得C16~C24范圍內(nèi)的烷烴具有好的降解性. 從圖 5c中可以看出，在反應(yīng)96 h后，固定化菌較游離菌對(duì)柴油的去除更為徹底，柴油內(nèi)不同組分均得到有效地降解.可能是疏水性固定化載體不僅與底物之間存在著高親和性，而且為降解菌的生長(zhǎng)提供了良好的微環(huán)境，促使菌株更容易與底物接觸并發(fā)生反應(yīng)，從而加快降解速率(Hou et al., 2013). 柴油中部分烴的降解產(chǎn)物可能對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生抑制作用，而載體對(duì)有毒底物的擴(kuò)散會(huì)產(chǎn)生一定的阻礙作用，使得固定化菌表面的實(shí)際毒物濃度降低，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用(Yamaguchi et al., 1999). Morris 等(2009)在對(duì)微生物降解后的柴油水溶液進(jìn)行GC-MS分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在4 min左右產(chǎn)生了大量的乙酸、酮類(lèi)、酯類(lèi)、戊二醇等物質(zhì)，這一結(jié)果與圖 5b中色譜峰的結(jié)果較為相似.因此，結(jié)合FTIR結(jié)果我們推測(cè)，Acinetobacter venetianus對(duì)柴油的降解是單末端氧化、次末端短氧化、雙末端氧化等多種氧化途徑綜合作用的結(jié)果.
圖 5 游離菌和固定化菌降解柴油溶液的GC-MS圖(a.柴油溶液空白對(duì)照組; b.游離菌降解柴油溶液;c.固定化菌降解后的柴油溶液)
4 結(jié)論
1)通過(guò)研究改性竹炭固定化Acinetobacter venetianus去除水體中的柴油，可知固定化菌對(duì)柴油的去除效果高于游離菌，對(duì)140 mg · L-1的柴油水溶液的去除率達(dá)到90.5%;而改性竹炭表面多孔的特性對(duì)柴油存在一定的吸附作用; 固定化菌對(duì)柴油的吸附協(xié)同降解過(guò)程擬合結(jié)果符合偽二級(jí)動(dòng)力學(xué)，這表明油類(lèi)分子首先被改性竹炭吸附，再被威尼斯不動(dòng)桿菌降解.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
2)通過(guò)對(duì)SEM結(jié)果分析，證實(shí)改性竹炭能夠很好地固定Acinetobacter venetianus.結(jié)合FTIR和GC-MS結(jié)果推測(cè)，柴油經(jīng)過(guò)威尼斯不動(dòng)桿菌降解之后，部分組分轉(zhuǎn)化為酮類(lèi)、羧酸類(lèi)，這表明在固定化菌在去除柴油不同組分的過(guò)程中存在著多種降解機(jī)制.
