1 引言
真菌是微生物群里對合成染料降解最高效的微生物.相對于細菌，真菌降解范圍的廣譜性及降解產(chǎn)物的無毒性使其逐漸引起人們的關(guān)注，但真菌本身對外界環(huán)境適應(yīng)的局限性也影響了其更廣泛的應(yīng)用.固定化是真菌投入到實際應(yīng)用的一種技術(shù)手段，可以使真菌細胞和液體培養(yǎng)基分離，使其免受水力剪切的破壞，并且固定化培養(yǎng)比游離培養(yǎng)能更好地抵抗外界環(huán)境的影響，如pH變化的影響或者暴露在高濃度化學(xué)品中對其造成的毒性影響.
固定化技術(shù)中，海藻酸由于無毒性且形成的凝膠對微生物的刺激性較小，成為相對比較合適的基質(zhì)材料.研究人員進行了大量關(guān)于海藻酸鈣包埋白腐真菌、藻類細胞的研究，但由于固定化真菌處理染料時首先是污染物在載體表面積累，然后被其內(nèi)部的菌絲降解，這一過程時間較長.為縮短固定化真菌對污染物的吸附時間，提高處理效率，本研究設(shè)計在固定化載體內(nèi)部加入吸附材料.
本研究選擇殼聚糖鐵凝膠作為改善固定化菌球性能的材料.殼聚糖鐵凝膠是一種合成的新型多聚物復(fù)合吸附材料，由于其多聚物特性使其具有較低的密度，能夠在海藻酸鈉溶液中處于懸浮狀態(tài)，并且在高速振蕩下能夠均勻分布在海藻酸鈉溶液中，適宜用于本研究.
過去固定化菌種的選擇中多以黃孢原毛平革菌為主，其在降解染料時，主要依靠分泌木質(zhì)素降解酶對染料進行降解，但使用的菌種多是從國外引進，并且木質(zhì)素產(chǎn)酶量制約了其在環(huán)境領(lǐng)域的大規(guī)模應(yīng)用.本研究選擇新疆本土采集的菌種作為固定化的菌種，經(jīng)ITS測序鑒定為疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)，屬于半知菌綱(deuteromycetes)，殼霉目，杯霉科，為目前已知的高產(chǎn)漆酶菌.漆酶是單電子氧化還原酶，通過生成底物自由基中間體及4個銅離子的協(xié)同作用催化不同類型底物氧化反應(yīng)，可以有效地降解難降解染料.本研究首次嘗試將疣孢漆斑菌固定化到海藻酸鈣中，并將殼聚糖鐵凝膠和疣孢漆斑菌結(jié)合起來，綜合分析其對染料的處理能力及處理機制，同時對結(jié)合后漆酶的活性進行檢測.
2 材料和方法
2.1 實驗材料
實驗選用的殼聚糖(脫乙酰度 91.04%)購自浙江金殼生化公司，氯化鐵、乙醇(分析純)、海藻酸鈉購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析用試劑ABTs購自Aladdin公司，實驗用染料為商用產(chǎn)品.實驗中用水為去離子水.
真菌菌種I-5由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院王洪凱老師提供，由其從新疆的腐殖地皮上分離采集，4 ℃下保存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，每3個月再次培養(yǎng).
2.2 殼聚糖鐵凝膠的制備
將殼聚糖粉末溶解在0.1 mol · L-1氯化鐵溶液中，攪拌4 h后加入乙醇，殼聚糖鐵固體析出，固體用乙醇沖洗以清洗多余FeCl3，并在80 ℃下干燥，干燥后的固體放在5%的戊二醛乙醇溶液中交聯(lián)2 h，用乙醇和去離子水梯度沖洗，然后置于烘箱中80 ℃烘干，即制備成殼聚糖鐵凝膠
2.3 真菌活化發(fā)酵
I-5真菌在28 ℃條件下在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)7 d，待菌絲布滿培養(yǎng)基后，用1 cm2打孔器在培養(yǎng)基上打孔，接種到PDB(Potato dextrose broth)中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于28 ℃、150 r · min-1條件下振蕩培養(yǎng).
2.4 真菌種類鑒別
為了鑒別I-5真菌的種類，需提取培養(yǎng)在PDA 上菌絲的DNA，并進行PCR擴增、測序.PCR擴增時采用的引物為通用引物ITS1、ITS4，上游引物ITS1-F: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，下游引物ITS4-R: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，PCR反應(yīng)體系見表 1，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30~40 s，55 ℃退火30~40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸5 min.PCR擴增后在瓊脂糖凝膠中進行電泳，將電泳后的凝膠置于Tanon 2500 成像系統(tǒng)中成像.電泳結(jié)束后的瓊脂糖凝膠回收純化后送到上海生物工程有限公司進行測序，將測序后的序列與電泳分析圖進行比較確定測定結(jié)果是否準(zhǔn)確，并在NCBI(National Center for Biotechnology information)上進行核苷酸的比對以確定該菌種的種類.
表1 PCR反應(yīng)體系
2.5 固定化
固定化即將培養(yǎng)的I-5菌種包埋到海藻酸鈉球中.將25 mL接種培養(yǎng)2 d的I-5菌培養(yǎng)基混合溶液同0.02 g · L-1的海藻酸鈉溶液(50 mL)混合后分成兩份，一份加入0.7 g殼聚糖鐵凝膠并用渦旋振蕩器混合均勻，另一份不加作為對照.混合溶液通過用1 mL注射器逐滴滴加至0.2 mol · L-1氯化鈣溶液中，并低速攪拌以防止粘結(jié).為了最小化菌絲的離散，本研究采用再包埋的方法(Daâssi et al., 2013)，將之前固定化好的小球用去離子水沖洗過后置于0.5 g · L-1 的海藻酸鈉溶液中，使球中的Ca2+和海藻酸鈉結(jié)合在球的表面再次形成一層海藻酸鈣層，最后用0.07 g · L-1的氯化鈉溶液沖洗(Enayatzamir et al., 2010).
2.6 脫色實驗
2.6.1 確定球/培養(yǎng)基最優(yōu)比例
固定化的真菌小球按照0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g · L-1的比例加入到等量相同的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1 d后，加入適量酸性紅73(AR73)，配成50 mg · L-1的含染料培養(yǎng)基，24 h后測定染料的脫色率，確定球/培養(yǎng)基最優(yōu)比例，反應(yīng)溫度為28 ℃.
2.6.2 對照試驗
最優(yōu)球/培養(yǎng)基比例下，在50 mL、50 mg · L-1 AR73染料培養(yǎng)基中，比較固定化殼聚糖鐵菌球、固定化菌球、滅活的固定化殼聚糖鐵菌球(采用2.5%的次氯酸鈉滅活)24 h染料的脫色率.
2.6.3 染料初始濃度的影響
在染料濃度為50、100、150、200、250 mg · L-1的條件下測定不同時間下固定化殼聚糖鐵菌球?qū)θ玖系拿撋首兓?
2.6.4 振蕩影響研究
比較靜態(tài)和150 r · min-1振蕩條件下固定化殼聚糖鐵菌球、固定化菌球不同時間段的染料脫色率.
2.6.5 對不同酸性染料的脫色
測定固定化殼聚糖鐵菌球?qū)λ嵝运{113(AB113)、酸性藍193(AB193)、酸性紅GR(AR9)、酸性黑10B(AB1)等不同染料24 h的脫色率.
2.7 漆酶活性測定
漆酶活性測定采用分光光度法，λ=436 nm(ε436=29300 L · mol-1 · cm-1)，用ABTS作為底物，300 μL、10 mmol · L-1 ABTs溶液和2670 μL醋酸鈉緩沖溶液(0.2 mol · L-1，pH=4.5)混合，30 ℃水浴下恒溫10 min，加入樣品30 μL，利用紫外分光光度計的Time course程序測定單位時間內(nèi)的數(shù)值變化，醋酸鈉緩沖溶液作空白.
2.8 固定化菌球表征
通過電子掃描顯微鏡研究菌球表面和橫截面的形態(tài)學(xué)，菌球的掃描電鏡圖(SEMs)利用SU8010在3.0 kV下檢測.由于樣品含真菌，在檢測前對樣品要進行前處理.
3 結(jié)果與討論
3.1 固定化菌球表征
實驗中制備的殼聚糖鐵固定化菌球表面(圖 1a、1b)和橫截面(圖 1c、1d)的掃描電鏡照片如圖 1所示.由1a可以看出，菌球的表面布滿了菌絲;圖 1b為固定化菌球表面1000倍的放大圖，可以更加細致地觀察到I-5菌絲的形態(tài)為長桿型，且在部分區(qū)域可以看到分生孢子.
圖1 殼聚糖鐵固定化菌球表面(a，b)及橫截面(c，d)掃描電鏡圖
圖 1c顯示出明顯分層現(xiàn)象，球表面由厚厚的菌絲包裹，內(nèi)部則是海藻酸鈣.從內(nèi)部放大圖(圖 1d)可以看到，在球體的內(nèi)部也生長有菌絲，其被海藻酸鈣緊緊包埋.由SEMs可以看出，疣孢漆斑菌在被海藻酸鈣固定化后長勢良好，具有較高的生長密度，便于在脫色實驗中更好地發(fā)揮作用.
3.2 真菌種類鑒別
圖 2的電泳分析圖顯示，I-5的條帶在500~750 bp之間，550 bp左右，而測出來的核苷酸序列長度也在這一范圍內(nèi)，所測出來的核苷酸序列與電泳分 析相符.將I-5的核苷酸序列放到NCBI上進行比對，比對出這種真菌和NCBI上ID為gb|KC140223.1|的序列相似度為99%，比對結(jié)果確定I-5真菌為疣孢漆斑菌.
圖2 I-5在EB著色的1.5%瓊脂糖凝膠DNA量電泳圖(M是Trans2K Plus DNA 標(biāo)記物)
測得I-5核苷酸序列如下：
>I-5
AAACTCCCAACCCTTTGTGACCTTACCATATTGTTGCTTCGGCGGGACCGCCCCGGCGCCTTCGGGCCCGGAACC AGGCGCCCGCCGGAGGCCCCAAACTCTTATGTCTTTAGTGGTTTTCTCCTCTGAGTGACACATAAACAAATAAAT AAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAA TTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTC GAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCCCCCAGTGCCTGGTGTTGGGGATCGGCCCAGCCTTCTCGCAAGGCCGCCGGC CCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGTCCTCCTCTGCGTAGTAGCACAACCTCGCAGTTGGAACGCGGCGGT GGCCATGCCGTTAAACACCCCACTTCTGAAAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATA TCAATAAGCGGAAGAAAT
3.3 球/培養(yǎng)基最優(yōu)比例確定
由表 2可以看出，接種量在0.15~0.25 g · L-1時，球?qū)θ玖系?4 h去除率能達到90%以上，且在20%時去除率達到最大.這同對固定化白腐真菌對染料的脫色研究結(jié)果相似，球的接種量比例都在20%左右，且由于本研究中殼聚糖鐵凝膠的加入，極大地改善了對染料的處理效果，研究的24 h的脫色率最高達50%左右.
表2 接種量(球/培養(yǎng)基)對染料去除的影響
3.4 對照實驗
為了判定固定化殼聚糖鐵菌球脫色染料時殼聚糖鐵和I-5菌絲各自對脫色所起作用的大小，設(shè)計了對照試驗.由于殼聚糖鐵凝膠在高溫高壓下吸附性能受到影響，因此，采用0.025 g · L-1的NaClO對固定化殼聚糖鐵菌球進行滅活，既不影響殼聚糖鐵的性能，同時便于操作.
由圖 3可以看出，與殼聚糖鐵固定化菌球相比，滅活后的菌球的脫色能力明顯衰退.滅活的殼聚糖鐵固定化菌球在24 h時對染料的去除效果達到平衡，表明在這段時間殼聚糖鐵凝膠對染料的吸附起主要作用;并且通過比較殼聚糖鐵固定化菌球和滅活殼聚糖鐵菌球兩條曲線的差異可以得出，疣孢漆斑菌在染料脫色中起著積極的作用，真菌處理染料的機制最主要的是生物吸附和生物降解.通過比較固定化菌球和滅活菌球的曲線差異，可以判別菌種降解所起到作用的大小.固定化菌球?qū)θ玖系拿撋�呈現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢，說明隨著時間延長，代謝產(chǎn)物酶的積累，菌絲的降解作用逐步增強，菌絲對染料的降解過程是一個緩慢的過程.同時，滅活的菌球?qū)θ玖弦灿胁糠秩コ芰�，證明海藻酸鈣對染料也有吸附作用，關(guān)于海藻酸鈣球?qū)ξ廴疚?如染料)有去除作用也有相關(guān)的研究報道.
圖3 滅活前后菌球?qū)θ玖系拿撋?150 r · min-1，pH=6.5，28 ℃)
3.5 染料濃度的影響研究
實驗研究了固定化殼聚糖鐵菌球?qū)Σ煌畛鯘舛热玖系拿撋什顒e，結(jié)果如圖 4所示，不同于之前普通的固定化菌球隨著染料濃度升高，脫色效果呈現(xiàn)差異較大的遞減趨勢的性質(zhì)，改良后的殼聚糖鐵固定化菌球?qū)Τ跏紳舛葹?0~150 mg · L-1的染料去除率能達到90%以上，而在染料初始濃度大于200 mg · L-1時，其去除率也高于70%，遠高于之前固定化菌球?qū)θ玖厦撋芯康男Ч?殼聚糖鐵固定化菌球在48 h內(nèi)對染料的去除效果能達到平衡，較之以往對真菌脫色染料的研究，改良后的菌球縮短了處理的時間，為真菌投入到處理廢水實際應(yīng)用增加了可能.
圖4 最初染料濃度對脫色率的影響(150 r · min-1，pH=6.5，28 ℃)
3.6 振蕩影響研究
殼聚糖鐵固定化真菌和固定化真菌在靜態(tài)和振蕩條件下對染料的脫色能力比較如圖 5所示，在靜態(tài)條件下，疣孢漆斑菌的固定化菌球?qū)θ玖系娜コ芰Φ陀谡袷帡l件下菌球的去除能力.振蕩條件可以滿足微生物對氧氣的需求，增加溶液中的溶解氧含量，增強氣-液之間的傳質(zhì)作用，加強菌絲的代謝，這可能影響菌絲的形態(tài)并且影響酶的合成率，對于染料的降解起到了積極的作用.另外，隨著固定化菌球培養(yǎng)時間的延長，染料的去除效果有了明顯的改善，固定化菌球和培養(yǎng)基中的染料接觸的過程時間較長，培養(yǎng)基中的染料首先被吸附到海藻酸鈣上，逐漸積累然后被降解.殼聚糖鐵凝膠的加入，大大縮短了染料吸附積累到球表面的時間，便于菌絲進行降解，從而提高了染料的去除效率.
圖5 振蕩(150 r · min-1)和靜態(tài)條件下對染料的去除比較
3.7 對不同染料的脫色研究
由于分子間的復(fù)雜結(jié)構(gòu)隨著有機鏈和相應(yīng)官能團的不同而發(fā)生變化，直接影響某些吸附材料的吸附性能.同時，研究發(fā)現(xiàn)，真菌對不同染料的降解能力也不盡相同.所以，為了判斷真菌和吸附材料結(jié)合以后對染料的去除效果，實驗研究了在相同條件下，殼聚糖固定化菌球?qū)ζ渌嵝匀玖?濃度為50 mg · L-1)的脫色效果.如圖 6所示，24 h后，殼聚糖鐵固定化菌球?qū)@幾種酸性染料的去除率均能達到90%以上，表明該材料對酸性染料的去除具有廣譜性.真菌和吸附材料的結(jié)合，既可以通過吸附材料的吸附降低染料對真菌產(chǎn)生的毒性影響，也可以通過真菌的降解作用擴大吸附材料的吸附閾值，兩者相互協(xié)同作用.
圖6 殼聚糖鐵固定化菌球?qū)Σ煌玖系拿撋?BR>
3.8 漆酶酶活測定
漆酶為疣孢漆斑菌在生長過程中所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，具有高氧化能力.漆酶被應(yīng)用在很多方面，最重要的就是脫色難降解的染料(Mishra et al., 2011)，這是因為漆酶含有4個銅原子提供了不同鍵位使其在催化機制中起到重要作用.漆酶的存在可以通過測定漆酶的活性來判斷，為了確定改良后的固定化菌球在處理染料時仍能產(chǎn)生漆酶，對投加菌球的染料取樣測定酶活性.結(jié)果表明，24 h時酶活性為(48.63±4.26)U · mL-1，48 h時為(81.40±3.18)U · mL-1.實驗數(shù)據(jù)表明，殼聚糖鐵固定化菌球投加到染料中后，菌絲具有較高活性.球中疣孢漆斑菌菌絲迅速增殖并覆蓋到菌球表面后，次級代謝產(chǎn)物逐漸積累，使測定的漆酶活性值呈現(xiàn)上升趨勢，有利于染料的降解.具體參見污水寶商城資料或http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
4 結(jié)論
殼聚糖鐵固定化菌球是對傳統(tǒng)固定化菌球的改良，也是對疣孢漆斑菌的一種新型應(yīng)用.殼聚糖鐵凝膠的加入縮短了水體中污染物集聚到機體表面的時間，提高了染料去除的效率;殼聚糖鐵的吸附作用可以降低高濃度染料對菌絲所產(chǎn)生的毒性，擴大菌球處理染料的閾值，使其對200~250 mg · L-1的染料仍能保持較高的去除率;對于固定化疣孢漆斑菌來說，動態(tài)培養(yǎng)更有利于其對染料的處理.殼聚糖鐵固定化菌球投加到染料后，菌絲具有較高活性，漆酶產(chǎn)量高，48 h達到(81.40±3.18)U · mL-1.殼聚糖鐵凝膠和疣孢漆斑菌的結(jié)合，相互協(xié)同，彌補了各自在處理某種染料的局限性，使其處理范圍更加廣泛，對于今后投入實際應(yīng)用具有很大的潛力.
