1 引言
目前，隨著現(xiàn)代工業(yè)的不斷發(fā)展，大量有毒有害廢水排入到環(huán)境中，苯酚作為樹(shù)脂制造、煉油、制藥、焦碳原料等工業(yè)過(guò)程中的重要工業(yè)原料和產(chǎn)生的一種有機(jī)污染物，是工業(yè)污水中的主要有害物質(zhì)，會(huì)對(duì)動(dòng)、植物產(chǎn)生有毒甚至致命的危害.苯酚對(duì)水生生物具有很強(qiáng)的毒害作用，水體中5~25 mg · L-1的濃度即可對(duì)魚(yú)類的生存構(gòu)成威脅.長(zhǎng)期飲用被苯酚污染的水或吸入低濃度酚蒸汽或會(huì)引起長(zhǎng)期累積性中毒，而飲用高濃度酚溶液、吸入高濃度酚蒸汽則將引起急性中毒，尤其對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)危害較大.美國(guó)環(huán)保署把苯酚列入129種優(yōu)先污染物和65種有毒污染物之列，我國(guó)也把苯酚列入中國(guó)環(huán)境優(yōu)先處理的污染物“黑名單”之中.因此，去除水體中的苯酚等酚類污染物已成為污水處理的重要課題.
降解酚類的方法主要包括吸附法，電化學(xué)法和生物降解法等，其中生物降解因投資與運(yùn)行成本低、二次污染小、處理效率高等優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛應(yīng)用于含酚廢水處理.近年來(lái)，許多學(xué)者在這方面進(jìn)行了大量的研究，從被酚類物質(zhì)污染的環(huán)境中已分離得到多種降解酚類的微生物菌株，主要有根瘤菌、酵母菌、醋酸鈣不動(dòng)桿菌、假單胞菌、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌、反硝化菌、紅球菌等.其中，大部分研究主要集中于酵母菌、芽孢桿菌以及假單胞桿菌，對(duì)Acinetobacter屬的細(xì)菌較少報(bào)道.生物降解法處理有毒和難降解的工業(yè)廢水時(shí)，一般需要利用生物強(qiáng)化技術(shù)來(lái)馴化、篩選、誘變和選育高效微生物降解利用有毒有害物質(zhì)，但工業(yè)廢水組成成分的動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)易對(duì)生物系統(tǒng)造成沖擊，使其中的高效降解微生物菌群致死、流失.利用高效降解微生物對(duì)苯酚進(jìn)行生物降解，能有效去除水體中的苯酚，但降解過(guò)程的影響因素較多，有必要從諸多影響因素中篩選出最為重要的影響因素，控制生物降解系統(tǒng)能較好的耐受環(huán)境沖擊并高效運(yùn)轉(zhuǎn).由于傳統(tǒng)單因素實(shí)驗(yàn)不能確定主次因素的差別，而Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用于生物過(guò)程重要參數(shù)的篩選，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，篩選出對(duì)目標(biāo)值影響最大的關(guān)鍵因素.響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是一種優(yōu)化過(guò)程的有效方法，其中的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法比較常用，可用于確定實(shí)驗(yàn)因素及其交互作用在過(guò)程中對(duì)指標(biāo)響應(yīng)值的影響，精確的表述因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系.該法與正交設(shè)計(jì)比較，所需實(shí)驗(yàn)組數(shù)相對(duì)較少，更能直觀體現(xiàn)因變量的最佳值.
本研究從株洲某化工廠污水處理車間氧化池的活性污泥中篩選分離出一株能高效降解苯酚的細(xì)菌菌株YH8，根據(jù)其形體特征、生理生化性狀、BIOLOG鑒定、16S rDNA和gyrB序列分析進(jìn)行分類鑒定，研究了該菌株降解苯酚的特性和初步探討了該菌株降解苯酚的途徑，并利用響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化菌株YH8降解苯酚的條件以提高降解效率.
2 材料與方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 樣品來(lái)源
從株洲市某化工廠廢水處理車間氧化池采集的活性污泥作為篩選降解菌株的樣品.
2.1.2 培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基(LB):每升含酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，pH 7.0~7.2.無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(MS):每升含K2HPO4 0.4 g、KH2PO4 0.4 g、NaCl 0.1 g、(NH4)2SO4 0.04 g、MgSO4 · 7H2O 0.1 g、MnSO4 · H2O 0.01 g、Fe2(SO4)3 · H2O 0.01 g、NaMoO4 · 2H2O 0.01 g，加水定容至1000 mL. 選擇培養(yǎng)基:在已滅菌的MS培養(yǎng)基中，按濃度要求加入經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾的苯酚母液(10 g · L-1水溶液)，pH 7.0.以上固體培養(yǎng)基需加入1.8%的瓊脂粉，經(jīng)121 ℃、20min高壓滅菌備用.
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 菌株的分離純化
準(zhǔn)確稱量氧化池活性污泥10 g，加入到裝有90 mL三級(jí)水的錐形瓶中，30 ℃、200 r · min-1恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)1 h.將重懸液按2%接種量加入到含苯酚的選擇培養(yǎng)基中，苯酚濃度按100、200、500、1000、1200、1500、2000 mg · L-1依次提高以梯度馴化與富集降解菌.經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，梯度稀釋培養(yǎng)液并涂布于含苯酚固體選擇培養(yǎng)基上，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h.挑取菌落形態(tài)不同的單菌落接種至LB平板上，反復(fù)劃線分離純化得到純菌株，保存于4 ℃冰箱中備用.
2.2.2 降解菌的篩選
將保藏的純化菌株接種至LB平板上，劃線分離單菌落.挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r · min-1振蕩培養(yǎng)至OD600為2.0(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期).連續(xù)活化3代后，用生理鹽水將發(fā)酵液離心洗滌2次并重懸菌體.以2%接種量接種至選擇培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)并間隔12 h檢測(cè)培養(yǎng)液中苯酚含量，從中挑選降解苯酚能力最強(qiáng)的菌株.
2.2.3 形態(tài)特征鑒定
肉眼觀察降解菌的菌落形狀、大小、顏色、透明度、粘稠度、濕潤(rùn)度、隆起和邊緣特征及是否產(chǎn)色素等，菌體染色后用高倍顯微鏡觀察菌體革蘭氏染色、鞭毛、莢膜、芽孢等結(jié)構(gòu)，利用日立S-3400N型掃描電鏡觀察菌體大小和表面結(jié)構(gòu).
2.2.4 生理生化特性測(cè)定
參照文獻(xiàn)進(jìn)行生理生化鑒定，另采用BIOLOG全自動(dòng)鑒定儀比對(duì)代謝指紋進(jìn)行鑒定.采用添加5 μg · mL-1的抗生素，濃度梯度為50、100、400、500、800、1000、1200、1500、2000 mg · L-1的重金屬鹽的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)YH8，檢測(cè)菌株的相關(guān)抗性.
2.2.5 16S
rDNA基因序列的測(cè)定及分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 細(xì)菌基因組DNA采用EasyPure Genomic DNA Kit試劑盒，依據(jù)說(shuō)明書(shū)提取.16S rDNA基因序列的獲取參照文獻(xiàn).PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)純化，送上海生工進(jìn)行雙向測(cè)序并拼接輸出全序列，16S rDNA序列用BLAST進(jìn)行相似性搜索和同源性比對(duì)，采用ClustalX 1.8進(jìn)行序列匹配分析，通過(guò)MEGA6.0軟件使用鄰接法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，利用Bootstrap(1000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的置信度.
2.2.6 gyrB基因序列的測(cè)定及分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建
gyrB基因是普遍存在于細(xì)菌中編碼促旋酶B亞單位的基因，該基因進(jìn)化速率快，每100萬(wàn)年的平均堿基替換率為0.7%~0.8%，gyrB基因彌補(bǔ)了非蛋白編碼基因16S rDNA無(wú)法區(qū)分近源種的缺陷.以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，采用gyrB的保守引物對(duì)UP-1F/UP-2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)步驟參照文獻(xiàn).利用測(cè)序引物UP-1S:5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3′和UP-2sr: 5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3′雙向測(cè)序并連接，gyrB序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的方法同上.
2.3 優(yōu)化降解條件
經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)確定影響YH8降解苯酚的環(huán)境因素.以苯酚降解率為響應(yīng)值，采用三步法進(jìn)行苯酚降解的優(yōu)化.首先，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)選出對(duì)菌株降解苯酚效率影響較大的因素，然后利用最陡爬坡設(shè)計(jì)逼近最佳區(qū)域，最后利用響應(yīng)曲面法中的Box-Benhnken設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn).通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合響應(yīng)面模型，最終確定最優(yōu)降解條件并進(jìn)行驗(yàn)證.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)借助SPSS和Design Expert軟件進(jìn)行分析.
2.4 苯酚降解機(jī)理的研究
2.4.1 細(xì)胞粗酶液的提取
將篩選到的菌株YH8接種至選擇培養(yǎng)基(含1000 mg · L-1苯酚)和LB培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r · min-1振蕩培養(yǎng)32h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期菌液50 mL，4 ℃、12000 r · min-1離心10 min，上清液即為胞外粗酶液，于-20 ℃凍存.菌體沉淀用pH 7.0的磷酸緩沖液清洗兩次后，重懸于磷酸緩沖液中.在冰浴中，用HUP-400A型超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，超聲破碎30 s，間隔30 s，連續(xù)處理10 min.于4 ℃、13000 r · min-1離心20 min，上清液即為胞內(nèi)粗酶液，于-20 ℃凍存.
2.4.2 菌株降解苯酚相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增
以細(xì)菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增苯酚羥化酶(LmPH)、鄰苯二酚2，3-雙加氧酶(C23O)和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶(C12O)基因片段.LmPH引物為L(zhǎng)ph:5′-AGGCATCAAGATCACCGACTG-3′;Lph2:5′-CGCCAGAACCATTTATCGATC-3′. C23O引物為C23OF:5′-GGTCTGATYGAAATGGAYCGCGA-3′;C23OR:5′-CGTTCGTTSAGCACCCGGTCGTG-3′. C12O引物為C12OF:5′-CCTGARCBGTHGGYTTT GCNCGTATGGATGA-3′;C12OR: 5′-TCACGRGTW GCRWARGCAAAGTC-3′.上述基因片段擴(kuò)增體系與16S rDNA基因序列擴(kuò)增體系相同，LmPH引物的PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5min;94 ℃變性30s，52 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10min.C12O和C23O的引物的PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性3min;94 ℃變性30s，59 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10min.PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)、純化、測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì).
2.4.3 質(zhì)粒的檢測(cè)與消除
采用堿裂解法抽提質(zhì)粒.質(zhì)粒消除采用變溫-SDS法.采用點(diǎn)接法將單菌落按相同位置接種至LB和選擇培養(yǎng)基的平板上，對(duì)能在LB平板上生長(zhǎng)而不能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株進(jìn)行質(zhì)粒檢測(cè).挑取質(zhì)粒消除突變菌株利用LmPH和C12O引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)突變菌株是否存在LmPH和C12O基因.
2.5 分析方法
2.5.1 細(xì)胞濃度的測(cè)定
采用可見(jiàn)分光光度法在600 nm下測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度(OD600).
2.5.2 苯酚濃度的測(cè)定
采用4-氨基安替比林直接分光光度法測(cè)定苯酚的含量.
2.5.3 粗酶液活性測(cè)定
苯酚羥化酶活性的測(cè)定參照文獻(xiàn).分別參考文獻(xiàn)檢測(cè)鄰苯二酚1，2-雙加氧酶(C12O)和鄰苯二酚2，3-雙加氧酶(C23O)催化降解鄰苯二酚的產(chǎn)物粘糠酸和2-羥基粘糠酸半醛，分別在260 nm和375 nm處有最大吸收峰.C12O和C23O酶活力測(cè)定以單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物分別在260 nm和375 nm處吸光度變化表示.反應(yīng)體系為8.01 mL鄰苯二酚、0.39 mL磷酸緩沖液(pH=7.0)和0.6 mL粗酶液，以緩沖液為參比.定義C12O(或C23O)活力單位(U)為25 ℃條件下每分鐘反應(yīng)產(chǎn)生1 μmol產(chǎn)物所需酶量.總蛋白含量用Bradford法測(cè)定，具體方法參見(jiàn)全式金Easy Protein Quantitative Kit試劑盒說(shuō)明書(shū).酶的比活力以每毫克的蛋白質(zhì)中所含酶的活力單位數(shù)計(jì)算.
3 結(jié)果與討論
3.1 菌株的分離與純化
從活性污泥中分離純化得到單菌落，劃線分離后獲得58株苯酚降解菌.通過(guò)復(fù)篩得到一株苯酚降解能力最強(qiáng)的菌株，命名為YH8.在馴化前，菌株YH8在苯酚濃度為1000 mg · L-1的選擇培養(yǎng)基中，經(jīng)30 ℃、200 r · min-1培養(yǎng)2d可使苯酚降解率達(dá)到78.54%.采用梯度濃度馴化后，菌株YH8可在4d內(nèi)使1200 mg · L-1的苯酚降解89.47%.
3.2 菌株的鑒定
3.2.1 形態(tài)特征鑒定
菌株YH8的菌落呈圓形、淺白色、中間隆起、邊緣整齊、濕潤(rùn)有光澤、較透明、較粘稠、不產(chǎn)色素.菌株細(xì)胞呈短桿狀，有莢膜，無(wú)鞭毛與芽孢.經(jīng)掃描電鏡觀察該菌在LB和選擇培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌株細(xì)胞差異，正常細(xì)胞表面較光滑，而苯酚則使該菌細(xì)胞表面出現(xiàn)凹陷(圖 1~圖 2).因苯酚在水溶液水解成酸性，高濃度的苯酚對(duì)細(xì)胞有一定的毒害作用，故選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞易出現(xiàn)破損等現(xiàn)象.
圖1 YH8在LB中的掃描電鏡圖(×20.0 k) 
圖2 YH8在苯酚中的掃描電鏡圖(×20.0 k)
3.2.2 生理生化鑒定
菌株YH8生理生化指標(biāo)如下:革蘭氏染色陰性、氧化酶陰性、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性、苯丙氨酸脫氨酶陰性、吲哚實(shí)驗(yàn)陰性、淀粉水解陰性、硫化氫陰性、三糖鐵陰性、硝酸鹽還原陽(yáng)性、V-P實(shí)驗(yàn)陰性、甲基紅陰性、明膠液化陽(yáng)性、纖維素酶陰性，4 ℃可生長(zhǎng)，40 ℃不能生長(zhǎng)，不具有運(yùn)動(dòng)性.將菌株YH8細(xì)胞懸浮液接種至BIOLOG GN2板微孔中，培養(yǎng)4h和16h后分別測(cè)定菌株代謝指數(shù).經(jīng)BIOLOG細(xì)菌鑒定系統(tǒng)分析，菌株YH8代謝指數(shù)與Acinetobacter guillouiae(Acinetobacter genospecies 11)的相似性為94%.
重金屬抗性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株YH8能在分別添加1.0 g · L-1 Pb2+、1.5 g · L-1 Cr6+、1.8 g · L-1 Cr3+、0.5 g · L-1 Cd2+、1.0 g · L-1 Sb3+、3.0 g · L-1 Mn2+、1.0 g · L-1 Cu2+和1.0 g · L-1 Zn2+的LB培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，低于1 g · L-1的Cr3+、Mn2+、Zn2+可促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)，而Cd2+、Hg2+、Ag+對(duì)菌株的生長(zhǎng)有強(qiáng)烈的抑制作用.同樣，龔斌從含有一定濃度的Cd2+、Pb2+、Mn2+、Ni2+的酚類廢水中篩選到一株具有重金屬抗性的假單胞菌JF-10，可用于重金屬污染水體的苯酚污染生物修復(fù).藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菌株YH8能耐受5 μ g · mL-1的氯霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、紅霉素，而對(duì)四環(huán)素、慶大霉素、壯觀霉素、頭孢噻肟鈉和利發(fā)霉素敏感.菌株在NaCl濃度為1%~12%的選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，表明菌株YH8可適應(yīng)較高滲透壓的環(huán)境.
3.2.3 分子生物學(xué)鑒定
菌株YH8的16S rDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增得到一條約1.5Kb的DNA片段，測(cè)序得到1448bp的序列，其GenBank登錄
號(hào)為KM658327.16S rDNA序列BLAST結(jié)果表明，菌株YH8與Acinetobacter guillouiae和Acinetobacter lwoffi的16S rDNA序列具有極高的同源性(99%).構(gòu)建的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖 3)表明菌株YH8與多株不動(dòng)桿菌處在同一個(gè)分支.
圖3 菌株YH8的16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得一段約1.3 kb的DNA片段，測(cè)序得到1182bp的序列，其GenBank登錄號(hào)為KM658329.gyrB序列BLAST結(jié)果表明，菌株YH8與Acinetobacter baylyi的gyrB序列具有很高的同源性(98%)，而與其它菌株gyrB基因相似性均在98%以下，系統(tǒng)發(fā)育分析(圖 4)表明，菌株YH8與Acinetobacter baylyi同處在一分支.因NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中暫未收錄Acinetobacter guillouiae的gyrB序列數(shù)據(jù)，故gyrB基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中與YH8同一分支中未出現(xiàn)Acinetobacter guillouiae.綜合16S rDNA和gyrB基因序列分析以及菌株形態(tài)和生理生化特征，菌株YH8鑒定為Acinetobacter guillouiae.
圖4 菌株YH8的gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
3.3 苯酚代謝途徑及相關(guān)降解酶特性測(cè)定
3.3.1 降解酶基因擴(kuò)增
按試劑盒說(shuō)明從菌株YH8中提取到基因組DNA.分別利用LmPH(Lph1/Lph2)、C12O(C12OF/ C12OR)、C23O(C23OF/ C23OR)引物對(duì)菌株YH8的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物L(fēng)mPH、C12O有明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖 5)，而C23O引物無(wú)明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物.將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，獲得LmPH基因大小為691 bp的片段，C12O基因大小為359 bp的片段.測(cè)序比對(duì)結(jié)果表明，菌株YH8的LmPH基因序列與登錄號(hào)為D85083.1的LmPH序列同源性最高，達(dá)到97%;該菌株的C12O序列與登錄號(hào)為Z36909.1的C12O序列同源性最高，達(dá)到96%.故證明菌株YH8基因組中包括LmPH和C12O基因.苯酚代謝途徑的限速步驟由第一步的苯酚羥化酶的催化決定，自然環(huán)境中有單組分和多組分兩種苯酚羥化酶，而多組分苯酚羥化酶是自然環(huán)境的優(yōu)勢(shì)類型(El-Sayed et al., 2014).(譚東徽等，2010)通過(guò)染色體步移技術(shù)克隆得到 總長(zhǎng)約為6 kb的苯酚羥化酶基因，其中ORF4(開(kāi)放閱讀框)編碼苯酚羥化酶大亞基，與編碼產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.)苯酚羥化酶大亞基基因的同源性達(dá)到93%，為構(gòu)建高效基因工程菌提供了一定的理論基礎(chǔ).
圖5 苯酚羥化酶基因片段和鄰苯二酚1，2雙加氧酶基因片段的擴(kuò)增產(chǎn)物
3.3.2 降解酶活性測(cè)定
通過(guò)測(cè)定菌株YH8粗酶液中LmPH、C12O和C23O的活性，初步判斷該菌株YH8降解苯酚的代謝途徑.菌株YH8粗酶活性檢測(cè)(表 1)表明，菌株YH8在LmPH的催化作用將苯酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，鄰苯二酚在C12O的作用下通過(guò)鄰位開(kāi)環(huán)裂解途徑降解.這與運(yùn)用氣質(zhì)聯(lián)用儀分析生物滴濾塔處理后的苯酚氣體檢測(cè)到的結(jié)果一致，推測(cè)苯酚的轉(zhuǎn)化形式也相同.菌體破碎后上清液中LmPH和C12O的活性遠(yuǎn)高于未破碎菌體上清液中酶活性，由此可見(jiàn)該酶為胞內(nèi)酶.以LB培養(yǎng)基為基質(zhì)的兩種上清液均未檢測(cè)到酶活，而選擇培養(yǎng)基中酶活遠(yuǎn)大于LB培養(yǎng)基中酶活，說(shuō)明該菌株LmPH和C12O為誘導(dǎo)酶.在研究四溴雙酚A(TBBPA)的微生物降解特性時(shí)，降解TBBPA的菌株H粗酶液中同樣檢測(cè)到一條明顯區(qū)別于純培養(yǎng)菌株的蛋白條帶，證明紅球菌株H相關(guān)降解酶是受TBBP誘導(dǎo)的特異性降解酶.
表1 不同基質(zhì)中苯酚相關(guān)降解酶比活力
3.3.3 質(zhì)粒檢測(cè)和消除結(jié)果
采用全式金transgen Plasmid MiniPrep Kit試劑盒抽提菌株細(xì)胞中的質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出現(xiàn)3條目的條帶，說(shuō)明菌株YH8具有一個(gè)5 kb左右的質(zhì)粒.經(jīng)變溫-SDS法消除質(zhì)粒后，通過(guò)點(diǎn)解法得到只能在LB平板上生長(zhǎng)而不能在僅含濃度為1000 mg · L-1 苯酚的MS培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌株(圖 6)，質(zhì)粒消除率可達(dá)57.73%.經(jīng)質(zhì)粒檢測(cè)，在質(zhì)粒消除后的突變菌株中未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒.挑取質(zhì)粒消除突變菌株培養(yǎng)并經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)，無(wú)LmPH和C12O基因擴(kuò)增條帶出現(xiàn)(圖 7).這說(shuō)明經(jīng)質(zhì)粒消除后的菌株不能利用苯酚作為唯一碳源生長(zhǎng)，且可初步判定苯酚相關(guān)降解基因位于質(zhì)粒上.結(jié)果與對(duì)不動(dòng)桿菌質(zhì)粒及其特性的研究結(jié)果一致.
圖6 LB(a)與苯酚(b)影印對(duì)照
圖7 質(zhì)粒消除前后LmPH和C12O基因擴(kuò)增結(jié)果(a. LmPH，b. C12O)
3.4 菌株YH8生長(zhǎng)及對(duì)苯酚降解的影響
3.4.2 菌株YH8利用苯酚生長(zhǎng)和降解苯酚曲線
將菌株YH8接種于含1000 mg · L-1 苯酚的MS培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r · min-1搖床培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定菌體生長(zhǎng)量及選擇培養(yǎng)基中的苯酚濃度.結(jié)果如圖 8所示，YH8菌株的生長(zhǎng)同步于對(duì)苯酚的降解，且菌株的生長(zhǎng)和降解曲線的遲緩期為0~12 h，這一時(shí)間段為菌株YH8細(xì)胞合成苯酚相關(guān)降解酶的誘導(dǎo)期.菌株在12~96 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，大約在 96 h最大菌體生長(zhǎng)量達(dá)到0.71，此時(shí)苯酚降解率達(dá)到94.52%.
圖8 菌株YH8利用苯酚生長(zhǎng)和降解苯酚曲線
3.4.3 環(huán)境因素對(duì)菌株YH8生長(zhǎng)和降解苯酚的影響
為了研究不同環(huán)境條件下菌株YH8對(duì)苯酚的降解情況，選擇苯酚濃度、溫度、接種量、初始pH、外加碳源、外加氮源5個(gè)影響因素作為研究對(duì)象，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菌株YH8在苯酚濃度為1000~1200 mg · L-1時(shí)具有較高的降解率，高于1200 mg · L-1時(shí)，OD600值和苯酚降解率隨苯酚濃度增加而迅速減小.菌株YH8生長(zhǎng)和降解苯酚的適宜溫度范圍為24~32 ℃，在30 ℃時(shí)菌株生長(zhǎng)量和降解率達(dá)到最大，即30 ℃初步確定為最適溫度.菌株YH8生長(zhǎng)和降解的臨界溫度為36 ℃，超過(guò)該溫度，菌株YH8的生長(zhǎng)和代謝便基本停止.菌株的最適接種量為5%，而菌株YH8在pH為9.0對(duì)苯酚的降解率達(dá)到最高.添加山梨醇和NaNO3作為最適外加碳源和外加氮源可有效提高菌體的生長(zhǎng)速度和降解率，而王玉芬等(2011)研究發(fā)現(xiàn)球形紅球菌只有在外加碳源的存在下才能降解氯代苯，而且不同碳源對(duì)氯代苯降解的影響變化較大，以蘋果酸和乙酸做碳源時(shí)的降解效果最好，這可能與球形紅球菌在好氧條件下必須通過(guò)共代謝才能降解氯代苯有關(guān).
3.5 菌株YH8降解苯酚條件的優(yōu)化
3.5.1 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
采用N=12 Placket-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究菌株YH8對(duì)苯酚的降解率產(chǎn)生影響的7個(gè)因素，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.11個(gè)考察因素及其編碼水平見(jiàn)表 2，其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以苯酚降解率為響應(yīng)值，借助實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design Expert 7.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其結(jié)果如表 3所示.通過(guò)比較各因素的顯著性水平，篩選出對(duì)苯酚降解率影響較為顯著的因素.
表2 Placket-Burman設(shè)計(jì)各因素與水平
從表 3可以看出，實(shí)驗(yàn)組5的苯酚降解率最高，達(dá)96.68%;實(shí)驗(yàn)組9的苯酚降解率最低，為35.78%.將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS V19.0擬合后，可得方程為:
Y= 71.02-9.87X2-0.91X3+6.33X5+9.56X6+10.23X8+1.44X9-1.69X10
式中，X2為苯酚濃度(mg · L-1);X3為接種量(%);X5為NaNO3濃度(%);X6為山梨醇濃度(%);X8為初始pH;X9為溫度(℃);X10為培養(yǎng)時(shí)間(h);X1、X4、X7、X11為空白變量.
表3 Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
應(yīng)用Design Expert軟件分析得到模型的p為0.0396，表明所得回歸方程較顯著，即該模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域擬合性較好.復(fù)系數(shù)R2=0.9244，說(shuō)明相關(guān)性較好.校正決定系數(shù)Adj R2=0.7921，表明79.21%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來(lái)解釋.通常情況下變化系數(shù)(Cv)越低，實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度越高，Cv值等于12.85%，表示PB實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度較好.精密度(Adeq Precision)是有效信號(hào)和噪聲的比值，大于4.0視為合理，本實(shí)驗(yàn)精密度達(dá)到9.663.根據(jù)回歸分析結(jié)果(見(jiàn)表 4)，從表 4可知苯酚濃度、山梨醇濃度以及初始pH對(duì)苯酚降解率存在顯著影響，其中初始pH的p值最小(p=0.0178)，對(duì)菌株YH8降解苯酚效率影響最顯著，其次是苯酚濃度(p=0.0200)，再次為山梨醇濃度(p=0.0222).其他4個(gè)因素，蔗糖濃度，苯酚濃度，溫度，培養(yǎng)時(shí)間p值均大于0.05，對(duì)苯酚降解率沒(méi)有明顯影響.由此，初始pH、苯酚濃度和山梨醇濃度為影響苯酚降解率的關(guān)鍵因素.
表4 Placket-Burman實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果
3.5.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析
響應(yīng)面擬合方程只有考察臨近區(qū)域時(shí)才能充分近似真實(shí)情況，所以應(yīng)先逼近最大苯酚降解率區(qū)域后再建立有效的擬合方程.
根據(jù)Placket-Burman 實(shí)驗(yàn)篩選出的3個(gè)顯著因素估計(jì)系數(shù)的正負(fù)效應(yīng)，依次增大或減小，其他因素根據(jù)估計(jì)系數(shù)的正負(fù)效應(yīng)分別取PB設(shè)計(jì)中的最高值和最低值.初始pH和胰蛋白胨濃度對(duì)苯酚降解率有顯著正效應(yīng)，應(yīng)依次增加.而接種量是負(fù)效應(yīng)，應(yīng)依次減少.其他因素的取值為接種量5%、NaNO3濃度2%、溫度30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間96 h.由表 5數(shù)據(jù)分析可知，隨著初始pH和山梨醇濃度的增加及苯酚濃度的減小，苯酚降解率呈先增大后減小的趨勢(shì).當(dāng)初始pH為9.0，苯酚濃度為1100 mg · L-1，山梨醇濃度為5%時(shí)，苯酚降解率達(dá)到最大.因此，序號(hào)5的實(shí)驗(yàn)為最大響應(yīng)值區(qū)域，故以此為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析.
表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
3.5.3 響應(yīng)面分析法確定最佳降解條件
響應(yīng)面分析法是一種尋找多因子系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，其中Box-Behnken和Box-Wilson中心組合設(shè)計(jì)是兩種較常見(jiàn)的響應(yīng)面分析法(RSA).通過(guò)爬坡路徑法確定降解條件重要影響因子范圍后，以初始pH、苯酚濃度和山梨醇濃度3種因子為自變量，以苯酚降解率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn).第13~15次實(shí)驗(yàn)為3次重復(fù)的中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，用于考察模型的誤差.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表 6.
運(yùn)用Design Expert 軟件對(duì)15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面值進(jìn)行回歸分析，得二次多項(xiàng)式方程:
Y= 98.51-8.04A+6.15B+1.96C+2.89AB+1.82AC+5.80BC-7.45A2-10.07B2-10.80C2
式中，Y為苯酚降解率;A、B、C分別為初始pH、苯酚濃度、山梨醇濃度的編碼值.相關(guān)系數(shù)R2=0.9972，說(shuō)明方程的擬合度很好，可以用該方程進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè).
表6 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
預(yù)測(cè)模型的p值遠(yuǎn)小于0.0001，說(shuō)明該模型極顯著.結(jié)合響應(yīng)面分析三維圖(圖 9)，可直觀的看出各因素之間的交互作用，各實(shí)驗(yàn)各因素對(duì)苯酚降解率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，且對(duì)響應(yīng)值的影響存在一極值點(diǎn).
圖9 菌株YH9各因素及其交互作用的響應(yīng)面圖
根據(jù)表 7方差分析數(shù)據(jù)可知，表明對(duì)苯酚降解率的影響排序?yàn)?初始pH(X2)﹥苯酚濃度(X6)﹥山梨醇濃度(X8).其中，X2、X6、X8、X2X6、X6X8、X22、X26、X28對(duì)Y的影響差異極顯著，X2X8對(duì)Y的影響高度顯著.失擬項(xiàng)數(shù)值為0.4185，遠(yuǎn)大于0.05，說(shuō)明失擬不顯著，該模型穩(wěn)定，可以作為不同因素水平對(duì)苯酚降解率影響的預(yù)測(cè).
根據(jù)模型構(gòu)建的方程進(jìn)行偏導(dǎo)微分處理，求導(dǎo)得出方程組的3個(gè)解:A=9.26，B=1163.63，C=7.81，即:初始pH 9.26、苯酚濃度1163.63 mg · L-1、山梨醇濃度7.81%.此時(shí)，YH8菌株對(duì)苯酚降解率的最大預(yù)測(cè)值為99.37%.
表7 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)回歸分析結(jié)果
3.5.4 驗(yàn)證試驗(yàn)
為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和有效性，按照優(yōu)化后的苯酚降解條件進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際檢測(cè)苯酚的降解率達(dá)到98.95%，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間具有良好的擬合性，表明回歸方程能夠比較真實(shí)的預(yù)測(cè)各因素對(duì)菌株YH8降解苯酚的影響.降解優(yōu)化實(shí)驗(yàn)組與未優(yōu)化實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的最佳降解條件可使菌株YH8對(duì)苯酚的降解率提高7%左右.等利用響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究了酵母浸出物、苯酚濃度、接種量3個(gè)因素對(duì)菌株Candida tropicalis Z-04降解高濃度苯酚效果的影響，擬合多元二次回歸方程，并得到最佳降解條件下的實(shí)際降解率與預(yù)測(cè)值高度接近，說(shuō)明響應(yīng)面法能有效預(yù)測(cè)并優(yōu)化菌株對(duì)目標(biāo)化合物的降解.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
4 結(jié)論
1)本研究從株洲某化工廠污水處理車間的污泥樣品中分離得到一株苯酚降解菌，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化、BIOLOG微生物全自動(dòng)鑒定儀和16S rDNA序列分析，該菌鑒定為Acinetobacter guillouiae，命名為YH8.該菌株能利用苯酚為唯一碳源和能源生長(zhǎng)，30 ℃、200 r · min-1培養(yǎng)96 h可使初始濃度為1200 mg · L-1的苯酚降解率達(dá)到92.65%.
2)在以苯酚為碳源和能源的培養(yǎng)基中，檢測(cè)到了與苯酚降解相關(guān)的主要酶活性-苯酚羥化酶和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶，證明菌株YH8主要通過(guò)鄰位開(kāi)環(huán)裂解途徑降解苯酚.對(duì)菌株YH8的相關(guān)降解酶研究表明，菌株YH8的相關(guān)降解酶位于胞內(nèi)，只有誘導(dǎo)后菌體才能產(chǎn)生鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的活性.利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增可從菌株YH8基因組中擴(kuò)增出一條251 bp的片段，測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示該片段為鄰苯二酚1，2-雙加氧酶基因片段.
3)通過(guò)質(zhì)粒檢測(cè)和消除發(fā)現(xiàn)菌株YH8具有一個(gè)5 kb左右的質(zhì)粒，且菌株YH8對(duì)苯酚的降解與質(zhì)粒有關(guān).此外菌株YH8可耐受多種重金屬和高濃度NaCl的存在.
4)采用Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出影響菌株YH8降解苯酚的主要因素為初始pH、苯酚濃度和山梨醇濃度.應(yīng)用響應(yīng)面法分析優(yōu)化設(shè)計(jì)苯酚降解的最佳條件為:初始pH 9.26、苯酚濃度1163.63 mg · L-1、山梨醇濃度7.81%、接種量5%、NaNO3濃度2%、溫度30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間96 h，在此條件下苯酚降解率可達(dá)98.95%.
