水體底泥中紅霉素菌株去除方法

　　1 引言

　　近年來(lái)，隨著抗生素的大量使用，其在環(huán)境介質(zhì)中的殘留已引起人們廣泛關(guān)注.雖然所檢出的抗生素殘留濃度水平未達(dá)到致死濃度，不足以抑制或者殺死微生物，但由于這些物質(zhì)大多數(shù)仍具有較強(qiáng)的生物反應(yīng)活性和富集放大效應(yīng)，當(dāng)達(dá)到最低抑菌濃度水平時(shí)，可能會(huì)促進(jìn)耐藥菌的發(fā)展和傳播，已有研究表明，長(zhǎng)期施用含有四環(huán)素的豬糞是環(huán)境中具有抗藥性致病菌的重要來(lái)源，同時(shí)，也是促進(jìn)其生成的主要推力.更為重要的是，耐藥菌所攜帶的耐藥基因可以長(zhǎng)期存在于土壤和水生細(xì)菌，甚至可能會(huì)傳遞至致病性更強(qiáng)的細(xì)菌，對(duì)人類健康造成極大威脅，因此，環(huán)境中抗生素的環(huán)境后效應(yīng)以及生態(tài)效應(yīng)成為近年環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一.紅霉素(Erythromycin，ERY)是一類大環(huán)內(nèi)酯類廣譜抗生素，具有強(qiáng)大的微生物抑制作用.人們已在污水、水源水和飲用水中檢測(cè)到ng · L-1~μg · L-1濃度的紅霉素污染.同時(shí)，殘留在自然水體中的抗生素有75%沉積在水底沉積物中，可形成水體底泥的抗生素蓄積性污染，進(jìn)而對(duì)底泥微生態(tài)造成影響，甚至誘導(dǎo)生物群體對(duì)紅霉素產(chǎn)生耐藥性.耐藥菌的存在不僅可加劇殘留抗生素的環(huán)境影響，更為重要的是能大大降低抗生素藥物生物抑制的有效性.目前，針對(duì)紅霉素耐藥性方面的研究大多側(cè)重于研究某單一菌種的耐藥行為以及紅霉素對(duì)土著微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，鮮有關(guān)于耐紅霉素菌群多樣性的研究，而關(guān)于耐藥菌群的研究也大多集中在磺胺類和四環(huán)素類.等抗生素.作為一種環(huán)境殘留率較高且廣泛使用的抗生素，研究環(huán)境中紅霉素耐受菌群的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，不僅有助于人們正確評(píng)價(jià)紅霉素的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，而且可為紅霉素藥物污染的防治提供理論依據(jù).

　　2 材料與方法

　　2.1 主要試劑及儀器

　　紅霉素購(gòu)自廣州華奇盛生物科技公司.配置100 μg · mL-1脫水紅霉素母液(用3 mol · L-1 H2SO4調(diào)節(jié)紅霉素溶液的pH值到3.0，在室溫下攪拌4 h)，4 ℃避光保存.

　　營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：10 g蛋白胨，5 g牛肉膏，5 g NaCl，1 L蒸餾水，調(diào)pH為7.0，固體培養(yǎng)基加20%的瓊脂粉.

　　其他生化試劑包括：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;Taq DNA聚合酶連接酶(BioReadyTaq Mix)，購(gòu)自杭州博日科技有限公司;UNIQ-10柱式膠回收試劑盒，T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司.相關(guān)引物合成，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成.

　　主要儀器：紫外分光光度計(jì)(島津UV-2550)，PCR儀(Bio-Rad S 1000TM Thermal Cycler);電泳儀(Bio-Rad PowerPac Basic);小型臺(tái)式離心機(jī)(LabogeneScanSpeed mini).

　　2.2 樣品采集

　　底泥樣品采自長(zhǎng)期受低濃度紅霉素污染的模擬水生生態(tài)系統(tǒng)，該系統(tǒng)的構(gòu)建參考美國(guó)環(huán)保署的標(biāo)準(zhǔn)方法.向室內(nèi)靜水養(yǎng)殖箱(80 cm×60 cm×40 cm)內(nèi)加入約20 kg的沉積物和60 L水，植入水蘊(yùn)草和斑馬魚(yú).實(shí)驗(yàn)期間室內(nèi)溫度控制在(30±2)℃，pH值控制在7.0±0.2、溶氧> 4 mg · L-1.系統(tǒng)穩(wěn)定后，每天向系統(tǒng)內(nèi)加入2.5 μg · L-1脫水紅霉素溶液，持續(xù)運(yùn)行1年時(shí)間，采集底泥樣品進(jìn)行分析.

　　2.3 實(shí)驗(yàn)方法

　　2.3.1 可培養(yǎng)耐紅霉素細(xì)菌的培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

　　分別取3份1.5 g新鮮底泥分別加入含有150 mL無(wú)菌水的三角瓶中，搖床振蕩3 h，制備成菌懸液，然后分別吸取適量，進(jìn)行混合.采用平板菌落計(jì)數(shù)法，取適量混合均勻的菌懸液進(jìn)行梯度稀釋后，分別涂布在制備好的紅霉素終濃度為16 μg · mL-1的營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上，每一濃度均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，30 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行抗性細(xì)菌計(jì)數(shù).

　　2.3.2 可培養(yǎng)耐紅霉素菌的分離與鑒定

　　選取2.3.1節(jié)中稀釋度適當(dāng)?shù)钠桨逄羧�單菌落，分別在30 ℃，150 r · min-1進(jìn)行液體培養(yǎng)24 h，再稀釋至適當(dāng)濃度進(jìn)行涂布，重復(fù)3~4次，直至平板上只生長(zhǎng)單一菌落.

　　提取純菌的細(xì)菌基因組DNA，利用細(xì)菌通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的純化及測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成.

　　2.3.3 樣品總DNA的提取

　　將2.3.1節(jié)中的菌懸液取適量加入到已滅菌的含有16 μg · mL-1紅霉素的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，150 r · min-1，30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后提取基因組DNA，得到的DNA樣品為底泥中耐紅霉素微生物的總DNA.

　　2.3.4 PCR擴(kuò)增

　　PCR擴(kuò)增引物：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)及1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′).

　　PCR反應(yīng)體系(25 μL)：DNA模板1 μL，ddH2O 10.5 μL，引物27F和1492R各0.5 μL，Taq酶12.5 μL.

　　PCR程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.

　　將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后進(jìn)行切膠回收，用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒純化進(jìn)行純化.

　　2.3.5 克隆文庫(kù)的構(gòu)建

　　利用細(xì)菌通用引物27F及1492R對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.將純化后的PCR產(chǎn)物用pUCm-T載體進(jìn)行目的基因連接，然后將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h;完后將其涂在含有IPTG和X-gal的氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜后挑取白色的陽(yáng)性克隆子，再用相同的方法進(jìn)行培養(yǎng);利用PstI 單酶切進(jìn)行陽(yáng)性克隆驗(yàn)證.驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆子測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成.測(cè)序結(jié)果通過(guò)CD-hit軟件基于序列相似度進(jìn)行聚類分析，劃分操作分類單元(Operational Taxonomic Unit，OTU);使用Estimate軟件繪制微生物稀有性曲線.利用稀有性曲線和文庫(kù)覆蓋率C評(píng)價(jià)文庫(kù)，文庫(kù)覆蓋率C計(jì)算公式為

　　式中，N代表陽(yáng)性克隆子總數(shù)，n1代表僅含單個(gè)克隆子的數(shù)量.

　　所有測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)后下載同源性序列，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的繪制借助MEGA5.0軟件完成.

　　3 結(jié)果與討論

　　3.1 可培養(yǎng)耐紅霉素細(xì)菌的計(jì)數(shù)與分離鑒定

　　根據(jù)抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，紅霉素的最低抑菌濃度(MIC)為8 μg · mL-1，本研究選擇略高于其MIC值的抗生素濃度，即紅霉素的終濃度為16 μg · mL-1.利用平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)抗性細(xì)菌的計(jì)數(shù)結(jié)果為9.86×108 CFU · g-1.將平板上形態(tài)各異的耐藥菌株進(jìn)行反復(fù)純化分離后，得到了3株獨(dú)立的菌株，其各自的形態(tài)如表 1中所示.

表1 可培養(yǎng)耐紅霉素菌菌落形態(tài)

　　分別將3株菌株的16S rDNA序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，確定與其最接近的種系群體.結(jié)合各菌株形態(tài)學(xué)特征及16S rDNA 序列分析，初步鑒定為賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)、土壤芽孢桿菌(Solibacillus silvestris)以及蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，各自在GenBank中的登錄號(hào)分為KP694229、KP694230、KP694231，且上述3種可培養(yǎng)菌均屬于芽孢桿菌綱.需要注意的是，蠟樣芽孢桿菌在自然界分布廣泛，是一種食源性致病菌，容易引起食物中毒，對(duì)紅霉素極度敏感，對(duì)青霉素耐藥.然而，本文的耐藥實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從底泥中分離出的蠟樣芽孢桿菌GD2C對(duì)紅霉素已表現(xiàn)出一定的耐藥性，這可能是菌株分離自長(zhǎng)期受低濃度紅霉素污染的環(huán)境，這意味著低濃度紅霉素的誘導(dǎo)作用可使蠟樣芽孢桿菌具備一定的耐藥性.

　　3.2 16S rDNA克隆文庫(kù)的分析

　　隨機(jī)挑取83個(gè)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序(序列長(zhǎng)均為1500 bp左右)，將測(cè)序結(jié)果在NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，將序列比對(duì)結(jié)果相似度大于等于97%的定義為一個(gè)操作單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)，共得到6個(gè)OTU，其中有2個(gè)OTU類型代表單克隆，最多的OTU類型包括36個(gè)克隆子.隨后以文庫(kù)覆蓋率C及稀有性曲線來(lái)評(píng)價(jià)所構(gòu)建的文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)該文庫(kù)覆蓋率為97.6%，且稀有性曲線趨于平緩，這意味著所構(gòu)建的克隆文庫(kù)庫(kù)容較大，所挑取的克隆子數(shù)量能夠較為完整的反映樣品中微生物的多樣性.上述兩項(xiàng)分析表明該克隆文庫(kù)所含83個(gè)克隆子能夠較全面地反映底泥中耐紅霉素細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的多樣性.

 圖1 底泥中耐紅霉素細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù)的稀缺性曲線 

　　樣品中16S rDNA克隆文庫(kù)結(jié)果如表 2所示，其中4個(gè)OTU的克隆子序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中已知細(xì)菌的16S rDNA序列相似度在97%以上，2個(gè)OTU的相似度低于97%.由比對(duì)結(jié)果可知，長(zhǎng)期受低濃度紅霉素污染的底泥中，耐紅霉素的細(xì)菌類群可分為三大類群，即：未獲培養(yǎng)細(xì)菌(Uncultured bacterium)、芽孢桿菌綱細(xì)菌(Bacilli)和梭菌綱細(xì)菌(Clostridia)，各涉及到2個(gè)OTU(54個(gè)克隆子)、3個(gè)OTU(28個(gè)克隆子)和1個(gè)OTU(1個(gè)克隆子).底泥樣品中耐紅霉素微生物中的優(yōu)勢(shì)菌群為某種未獲培養(yǎng)的細(xì)菌，在文庫(kù)中占43.37%，其次是蘇云金芽孢桿菌，占文庫(kù)的24.10%.

表2 底泥中耐紅霉素細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù)結(jié)果 

　　蘇云金芽孢桿菌是一種有益桿菌，多用做殺蟲(chóng)劑，目前對(duì)于其耐藥性的報(bào)道較少，但從文庫(kù)結(jié)果來(lái)看，蘇云金芽孢桿菌已對(duì)紅霉素產(chǎn)生了一定的耐藥性;另外，紅霉素原本對(duì)梭狀芽孢桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，在本研究中也表現(xiàn)出了一定的耐藥性，這可能也是因?yàn)榄h(huán)境中殘留的低濃度紅霉素對(duì)其誘導(dǎo)，使其對(duì)紅霉素產(chǎn)生了一定的抗性，這也進(jìn)一步說(shuō)明了環(huán)境中殘留抗生素存在潛在影響.由克隆文庫(kù)結(jié)果可以看出，在已知菌屬中，芽孢桿菌屬所占比例最大，這與上述所篩選分離出的可培養(yǎng)的耐藥菌均為芽孢桿菌屬細(xì)菌的結(jié)果是互相吻合的.

　　另外，構(gòu)建的16S rDNA文庫(kù)中有25.3%(21個(gè)克隆子)的細(xì)菌與GenBank中已知細(xì)菌的16S rDNA序列同源性低于97%，而在序列同源性研究中，一般認(rèn)為細(xì)菌16S rDNA序列同源性低于97%即屬于不同的種，這說(shuō)明底泥中蘊(yùn)藏著許多未知的耐藥細(xì)菌，有待于進(jìn)一步深入研究.

　　3.3 底泥樣品16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

　　分子系統(tǒng)發(fā)育分析，特別是對(duì)細(xì)菌16S rDNA基因的同源性進(jìn)行分析有助于了解微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性.將表 1和表 2中的3株單菌和6個(gè)OTU的堿基序列及其相應(yīng)的同源性序列進(jìn)行聚類分析后，以嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilus(NR042778)為外類群，繪制出底泥中耐紅霉素細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖 2.

　　由圖 2可見(jiàn)，土壤芽孢桿菌GD2B的堿基序列與OTU4的堿基序列之間相似度較高，且與OTU1存在較好的親緣關(guān)系.因而將OTU1和OTU4的序列進(jìn)一步在RDP數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其最大相似菌株Uncultured bacterium clone(DQ337010)和Uncultured bacterium clone(AB506332)可以進(jìn)一步劃分到某未分類的動(dòng)性球菌屬(Unclassified Planococcaceae)，而土壤芽孢桿菌和動(dòng)性球菌屬均屬于動(dòng)球菌科(Planococcaceae)，所以O(shè)TU1、GD2B以及OTU4在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中聚集到一起.蠟樣芽孢桿菌GD2C與OTU5的最大相似菌株蘇云金芽孢桿菌存在較好的親緣關(guān)系，這是由于蘇云金芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌均屬于蠟樣桿菌屬，兩者之間具有高度的同源性.

 圖2 底泥中耐紅霉素細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 

　　紅霉素作為第一代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，自1952年應(yīng)用于臨床以來(lái)，一直被人們長(zhǎng)時(shí)間大劑量使用，使得多種原本敏感的微生物對(duì)其產(chǎn)生了抗性(李喆宇等，2013)，比如肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌等.而本研究發(fā)現(xiàn)的芽孢桿菌，相關(guān)報(bào)道尚不多見(jiàn).于雅瓊等(2007)發(fā)現(xiàn)，分離自土壤、飼料和肥料的芽孢桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素表現(xiàn)出一定的敏感性.本研究顯示，經(jīng)過(guò)為期1年的低濃度紅霉素脅迫，芽孢桿菌對(duì)紅霉素已表現(xiàn)出一定的耐藥性，3株可培養(yǎng)的紅霉素耐藥菌及紅霉素耐藥菌克隆文庫(kù)中有33.73%均屬于芽孢桿菌.這可能是由于：①不同劑量使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物，在機(jī)體內(nèi)存在誘導(dǎo)出耐藥株的可能性(劉禧杰，2008);②微生物細(xì)胞可以通過(guò)基因的水平轉(zhuǎn)移或者可移動(dòng)遺傳因子獲得抵抗力(李晶，2013)，通過(guò)抗性基因的水平轉(zhuǎn)移獲得耐受紅霉素基因，從而獲得對(duì)紅霉素的抵抗力.當(dāng)細(xì)菌具有抗生素抗性后，可能會(huì)對(duì)細(xì)菌代謝產(chǎn)生特定的改變(如抗重金屬污染等特性)，甚至可使細(xì)菌在某些環(huán)境中更具有生存優(yōu)勢(shì);而存在于基因轉(zhuǎn)移單位的抗性基因，則可以自我復(fù)制，從而一直存在于微生物群落里(楊穎，2010)，這必將引發(fā)巨大的潛在危害，并威脅到環(huán)境及人類健康.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　4 結(jié)論

　　1)用傳統(tǒng)方法從底泥中篩選出的3株芽孢桿菌綱耐紅霉素菌株，結(jié)合各菌株形態(tài)學(xué)特征及16S rDNA序列分析，初步鑒定為賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)、土壤芽孢桿菌(Solibacillus silvestris)以及蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus).其中原本對(duì)紅霉素極度敏感的蠟樣芽孢桿菌，由于低濃度紅霉素的馴化，對(duì)紅霉素產(chǎn)生了一定的耐藥性.

　　2)長(zhǎng)期受低濃度紅霉素污染的底泥中，耐紅霉素的細(xì)菌類群分三大類群，即：未獲培養(yǎng)的細(xì)菌、芽孢桿菌綱和梭狀芽孢桿菌綱.其中未獲培養(yǎng)的細(xì)菌在整個(gè)文庫(kù)中比例最大，可培養(yǎng)的耐藥菌的優(yōu)勢(shì)類群為芽孢桿菌綱.結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析，發(fā)現(xiàn)所占比例最大的某未獲培養(yǎng)的細(xì)菌為某種未分類的動(dòng)性球菌(43.37%)，可初步劃分到芽孢桿菌綱(Bacilli)，尚需更多地分類鑒定.在16S rDNA克隆文庫(kù)中，有25.3%的細(xì)菌與GenBank中已知細(xì)菌的序列同源性低于97%，這說(shuō)明底泥中蘊(yùn)藏著許多未知的耐藥細(xì)菌，有待于進(jìn)一步深入研究.

　　3)通過(guò)對(duì)16S rDNA文庫(kù)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)紅霉素具有一定耐藥性的細(xì)菌既有致病菌(例如蠟樣芽孢桿菌)，也有有益菌(例如蘇云金桿菌).隨著各種抗生素使用量的增加，一方面，使得原本對(duì)抗生素有一定敏感度的致病菌表現(xiàn)出了一定的耐藥性，對(duì)疾病的防治加大了難度;另一方面，也使得環(huán)境中某些有益菌獲得了一定的耐藥性，使其可以更好的生存.在抗生素污染問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重的今天，有益的芽孢桿菌的應(yīng)用研究，可能是解決抗生素問(wèn)題的一個(gè)有效方案.