1 引言(Introduction)
長期以來, 好氧生物處理工藝始終存在高耗能的弊端.一方面, 污水處理廠60%的能耗來自于鼓風機消耗, 目前我國污水處理廠的平均電耗為0.292 kW·h·m-3, 13%以上的污水廠電耗超過0.48 kW·h·m-3, 即使在美國, 其城市污水處理的電耗也要占總電耗的3%以上(曲久輝, 2014).另一方面, 城市污水作為資源循環(huán)利用的重要載體, 潛在能量巨大, 有待開發(fā).然而, 目前我國城市污水的循環(huán)利用僅限于水資源的循環(huán)利用, 忽視了污水處理過程中有機質(zhì)的循環(huán)利用.厭氧處理作為一種低成本的廢水處理技術(shù), 不僅可以進行污水處理, 而且可以實現(xiàn)能源回收, 近年來得到國內(nèi)外學者的密切關(guān)注.
厭氧生物處理技術(shù)一般應用于處理高濃度有機廢水, 而有關(guān)其用于處理低濃度生活污水的研究相對較少(McCarty, 1981).早在1989年, Sanz等就將厭氧流化床反應器(AFBR)應用于生活污水處理, 發(fā)現(xiàn)即使在低于10 ℃的低溫環(huán)境下, COD去除率也能達到70%以上(Sanz et al., 1989; 1990), 但其COD與SS仍不能滿足嚴格的污水處理排放標準.隨著膜技術(shù)的發(fā)展, Fang等將膜技術(shù)與厭氧生物處理相結(jié)合, 開發(fā)了厭氧膜生物反應器(AMBR), 膜組件的加入有效地截留了固體懸浮物且避免了活性污泥的流失, 極大地提高了出水水質(zhì)(Fang et al., 2006;Bérubé et al., 2006), 然而膜污染問題接踵而至.Kim等(2011)針對此問題, 加入顆�；钚蕴�, 利用顆�；钚蕴孔鳛樯镙d體, 并將其充分流化使其對膜組件進行沖刷, 開發(fā)了厭氧流化床膜生物反應器(AFMBR), 實驗證明, 膜污染得到了一定程度的控制且出水狀況良好.
然而, 這些厭氧膜生物反應器配水使用的有機物是醋酸鹽或丙酸鹽, 相對于生活污水中復雜的有機污染物來說更容易被降解利用.為此, 本研究以蔗糖、蛋白胨為碳源對AFMBR的運行進行探究.張博康等(2018)對AFMBR的能耗及產(chǎn)能進行了實驗分析, 結(jié)果表明, 若只考慮氣態(tài)甲烷產(chǎn)能, 當HRT降至10 h時, 該系統(tǒng)產(chǎn)能已是能耗需求的2倍, 因此, AFMBR作為一種低耗高效的廢水處理系統(tǒng), 具有良好的發(fā)展?jié)摿?
厭氧微生物是污水厭氧消化的主體.在厭氧消化反應器中, 底物的差異對污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)的形成及代謝過程有重要影響(Fernandez et al., 2008).即使在處理相同底物的不同厭氧消化反應器中, 微生物群落仍呈現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)(劉君寒等, 2011).本實驗系統(tǒng)采用的碳源為蔗糖、蛋白胨, 相對于醋酸鹽和丙酸鹽這類碳源更復雜、更難降解與利用, 且目前有關(guān)AFMBR系統(tǒng)微生物的研究較少.因此, 本研究利用宏基因組測序及高通量技術(shù), 從微生物菌群、功能基因、代謝途徑等不同角度對AFMBR系統(tǒng)進行分析, 探尋微生物群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律與厭氧消化的內(nèi)在關(guān)系, 以期為AFMBR高效穩(wěn)定的運行提供科學依據(jù), 同時推動厭氧污水處理技術(shù)的進步與發(fā)展.
2 材料與方法(Materials and method)
2.1 反應器的構(gòu)造及運行條件
厭氧流化床膜生物反應器(AFMBR)如圖 1所示(張博康等, 2018).AFMBR由一個主反應柱和兩個沉淀室組成, 其有效容積為30 L.在主反應柱內(nèi)部設(shè)置有60根1 m長的聚偏氟乙烯(PVDF)中空纖維膜(公稱孔徑為0.4 μm), 總有效面積為0.2475 m2.
圖 1
圖 1 AFMBR系統(tǒng)示意圖(1.進水蠕動泵, 2.反應柱, 3.沉淀室, 4.循環(huán)磁力泵, 5.轉(zhuǎn)子流量計, 6.壓力傳感器, 7.出水蠕動泵, 8.顆粒活性炭, 9.中空纖維膜, 10.pH電極, 11.ORP電極, 12.DO電極, 13.液位控制器, 14.集氣)
AFMBR的實驗用水為模擬生活污水, 其水質(zhì)組成參照馮華軍等(2011)對浙江省典型地區(qū)生活污水水質(zhì)檢測數(shù)據(jù), 進行人工模擬配水, 其配水水質(zhì)如表 1所示, 其中, 有機碳源組分主要為蔗糖和蛋白胨, 此外, 還包含有NH4HCO3、尿素、K2HPO4、KH2PO4、NaHCO3.
表 1 本次研究中試驗廢水水質(zhì)
AFMBR系統(tǒng)連續(xù)運行218 d, 整個過程分為4個階段.系統(tǒng)內(nèi)的pH維持中性, 溫度為20~38 ℃, ORP在-506 mV左右, 均滿足厭氧微生物的需要, 不需人為調(diào)整.
2.2 樣品采集
AFMBR的接種污泥取自北京市某污水廠的污泥濃縮池, 污泥濃度(MLVSS)為80.35 g·L-1.AFMBR運行前, 取種泥經(jīng)離心后放入超低溫冰箱中(-76 ℃)以備高通量測序.AFMBR運行結(jié)束時, 自取樣口2、3、4(圖 1)取泥樣.從取樣口2、3、4采集顆粒活性炭, 經(jīng)液氮冷凍、研磨后放入超低溫冰箱中以備宏基因組測序.
2.3 高通量測序
接種污泥委托上海生工公司進行高通量測序, 具體步驟參照譚瀟等(2017)的研究.首先提取DNA, 對種泥細菌16S rDNA基因的V3區(qū)進行PCR兩輪擴增, 引物如表 2所示.對種泥古菌16S rDNA基因的V3~V4區(qū)進行3輪擴增, 引物如表 3所示.細菌和古菌擴增的PCR產(chǎn)物和正常擴增片段在400 bp以上的PCR產(chǎn)物, 選用0.6倍的磁珠(Agencourt AMPure XP)進行處理.繼而利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量, 按照1:1等量混合后測序.等量混合時, 每個樣品DNA量取10 ng, 最終上機測序濃度為20 pmol.
表 2 AFMBR系統(tǒng)接種菌群細菌所用引物
表 3 AFMBR系統(tǒng)接種菌群古菌所用引物
2.4 宏基因組測序
AFMBR系統(tǒng)連續(xù)運行結(jié)束后的泥樣委托上海生工公司進行宏基因組測序.宏基因組測序是對系統(tǒng)內(nèi)的功能基因進行進一步的分析, 從基因角度分析系統(tǒng)的代謝過程, 同時也對系統(tǒng)內(nèi)微生物組分進行分析.宏基因組測序的DNA提取方法與高通量測序方法相同, DNA在瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 使用Covaris儀器通過超聲波將DNA片段化, 選擇合適的打斷參數(shù)條件使打斷的DNA片段大小集中在300~500 bp范圍內(nèi).樣品片段化結(jié)束后, 對其進行末端修復并再次進行片段化.連接接頭后, 采用NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix擴增PCR.PCR結(jié)束后, 利用0.6倍的Agencourt AMPure XP-核酸純化磁珠對PCR反應產(chǎn)物進行純化, 并通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測構(gòu)建完整的文庫PCR純化產(chǎn)物.使用DIAMOND將基因集蛋白序列與Nr (NCBI non-redundant protein sequences)數(shù)據(jù)庫進行blastp同源性比對, 得到功能注釋和同源物種信息, 篩選條件：E-value < 1×10-5, Score>60.同時根據(jù)NCBI的微生物分類學信息數(shù)據(jù)庫, 獲得基因的物種分類注釋信息, 并在Kingdom (界)、Phylum (門)、Class (綱)、Order (目)、Family (科)、Genus (屬)、Species(種)各個分類學水平上統(tǒng)計物種的相對豐度.使用GhostKOALA將基因集蛋白序列與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對, 得到序列對應的KO號, 根據(jù)KO與Pathway和Module的聯(lián)系得到序列的Pathway、Module注釋信息, 并統(tǒng)計KEGG各功能層級在各個樣本中的豐度.
3 結(jié)果與討論(Results and discussion)
3.1 AFMBR系統(tǒng)運行特性
AFMBR反應器的運行工況及條件如表 4所示(張博康等, 2018).AFMBR系統(tǒng)連續(xù)運行結(jié)束時的數(shù)據(jù)表明, 經(jīng)過馴化富集后系統(tǒng)的出水COD能穩(wěn)定維持在30 mg·L-1以下, COD滿足一級A出水標準(GB18918—2002);其中, 進水COD約有50%轉(zhuǎn)化為甲烷;污泥產(chǎn)量為0.076 g·g-1 (以每克COD中的VSS計), 遠低于典型的好氧系統(tǒng)的污泥產(chǎn)量;如若只考慮氣態(tài)甲烷產(chǎn)能, HRT為10 h時產(chǎn)能已是能耗需求的2倍(張博康等, 2018).
表 4 AFMBR系統(tǒng)的運行特性
3.2 AFMBR系統(tǒng)運行前后菌群在屬水平的變化
AFMBR接種污泥的微生物菌群在屬水平上的相對豐度(>1%)如表 5所示.從表 5中可以看出, 接種菌群中細菌在屬水平的相對豐度以Petrimonas、Syntrophomonas、Alkaliphilus占比較高, 分別為7.71%、5.78%、5.42%;此外, 還有Tissierella、Nitrobacter等許多其它菌屬.接種菌群中古菌在屬水平的相對豐度以Methanoculleus菌屬占比較高, 占所有古菌的76.49%.Methanobacterium、Methanobrevibacter、Thermogymnomonas等菌屬占比較小.
表 5 AFMBR系統(tǒng)接種菌群屬水平的相對豐度
AFMBR系統(tǒng)運行結(jié)束時菌群在屬水平的平均相對豐度(>1%)如表 6所示.從表 6中可以看出, 與種泥相比, 運行結(jié)束時細菌與古菌的優(yōu)勢菌屬變化均較大.細菌菌屬除去未命名的菌屬, 占比較高的Synergistes、Dehalobacter、Treponema分別占3.95%、3.64%、3.54%.古菌菌屬主要為Methanosarcina(甲烷八疊球菌屬)和Methanobacterium(甲烷桿菌屬), 分別占62.95%、28.01%.AFMBR系統(tǒng)接種細菌菌屬中的Petrimonas必須以單質(zhì)硫和硝酸鹽為電子受體(Grabowski et al., 2015);Syntrophomonas以質(zhì)子為電子受體, H2作為電子吸收產(chǎn)物, 且在有H2存在的環(huán)境中會受到明顯抑制(Mcinerney et al., 1981);Alkaliphilus是一種極度嗜堿微生物(Takai, 2001);Nitrobacter為硝化菌, 需在好氧條件下生存.Petrimonas、Syntrophomonas、Alkaliphilus與Nitrobacter皆因AFMBR系統(tǒng)無法提供相應的生存條件而被篩選淘汰.AFMBR系統(tǒng)運行結(jié)束時細菌菌屬中的Synergistes、Dehalobacter皆為專性厭氧細菌, Dehalobacter可利用乳酸產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸, 且可通過產(chǎn)生的氫氣脫氯(Yoshida et al., 2009;Kato et al., 2010;Li et al., 2015), Synergistes也恰好須與耗氫微生物互養(yǎng).系統(tǒng)的嚴格厭氧條件更有利于這些菌屬生長, 其代謝途徑也與厭氧微生物的碳代謝過程相吻合, 因此, 屬水平上的種群變化是該反應器高效能的直接體現(xiàn).
表 6 AFMBR系統(tǒng)運行結(jié)束時菌群屬水平的平均相對豐度
從古菌菌屬來看, 系統(tǒng)運行前后的產(chǎn)甲烷菌屬占比分別為90.94%與91.01%, 但優(yōu)勢菌屬由接種時的Methanoculleus(76.49%)轉(zhuǎn)變?yōu)镸ethanosarcina(62.95%)與Methanobacterium(28.01%).基于代謝基質(zhì)差異分類, Methanoculleus、Methanosarcina與Methanobacterium分別屬于氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群、乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群與多營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群.由此可得出AFMBR系統(tǒng)產(chǎn)甲烷基質(zhì)由最初的主要以氫氣提供為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐砸宜釣橹?具體聯(lián)系污水寶或參見http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
3.3 AFMBR系統(tǒng)運行結(jié)束時菌群在種水平的特性
依據(jù)宏基因組分析, AFMBR系統(tǒng)運行結(jié)束時菌群在種水平的相對豐度如表 7所示.從表 7中可以看出, 各菌種所占的比例相差不大, Bacteroidales_bacterium_CF、Synergistaceae_noname、Dehalobacter_sp._FTH1、Methanosarcina_barkeri等菌種的占比略高于其他菌種.
表 7 AFMBR系統(tǒng)運行后菌群在種水平的相對豐度
對表 7中的微生物菌種進行分析, 依據(jù)厭氧消化三階段理論進行分類, 具體如表 8所示.水解發(fā)酵菌群中Cloacibacillus_evryensis、Synergistes_jonesi能夠發(fā)酵氨基酸, 不能在糖類、有機酸/醇內(nèi)生長(Ganesan et al., 2008).而Treponema_caldarium、Endomicrobium_proavitum、Lentimicrobium_saccharophilum則能夠發(fā)酵碳水化合物, 不同底物的發(fā)酵產(chǎn)物也不盡相同(Bravo et al., 2013;Sun et al., 2016;Zheng et al., 2016).Synergistes_sp._3_1_syn1能夠產(chǎn)生天冬氨酸蛋白酶分解蛋白質(zhì)(Kumar et al., 2010;Walsh et al., 2015).Syntrophorhabdus_aromaticivorans在與氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)時能夠降解苯酚, 代謝產(chǎn)物為乙酸和甲烷(Qiu et al., 2008).Melioribacter_roseu是兼性厭氧菌, 可以通過好氧呼吸在單糖、二糖及多糖中生長, 也可以通過還原不同的電子受體(亞硝酸鹽、Fe(Ⅲ)、As(Ⅴ))進行發(fā)酵(Kadnikov et al., 2013;Tsapekos et al., 2017).
表 8 AFMBR系統(tǒng)內(nèi)厭氧菌群分類
產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群中Bacteroidales_bacterium_CF可以發(fā)酵乳酸和乙醇(Tang et al., 2013).Dehalobacter_sp._FTH1是厭氧脫鹵桿菌的一種, 可以利用乳酸產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸, 并且可以通過產(chǎn)生的氫氣脫氯(Yoshida et al., 2009;Kato et al., 2010;Li et al., 2015).Pelotomaculum_thermopropionicum是一種厭氧生物降解系統(tǒng)中典型的互養(yǎng)菌, 能夠促進中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化, 且能夠?qū)l(fā)酵細菌產(chǎn)生的VFA和乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸鹽、氫氣和二氧化碳(Kato et al., 2010;Leng et al., 2017).
產(chǎn)甲烷菌群中, Methanosarcina_barkeri、巴氏甲烷八疊球菌屬可以利用甲醇、醋酸、甲胺及不同形式的氫和二氧化碳, 雖然其生長緩慢, 但能適應環(huán)境中各種可用的能源, M. barkeri可以在低pH的生態(tài)系統(tǒng)存活, 并且能夠有效地中和酸性環(huán)境, 相對于其他的產(chǎn)甲烷菌抗沖擊性更強(Rocheleau, 1999;Lin et al., 2017);Methanobacterium_formicicum是甲酸甲烷桿菌, 利用分子態(tài)氮為氮源進行生長, 細菌產(chǎn)生甲烷的速率與氮氣濃度有關(guān), 在沒有氮氣或其他氮源的情況下, 細菌完全停止生長(Schauer et al., 1980;Magingo et al., 1991).
通過對AFMBR運行后的菌群進行分析可以看出, 在AFMBR運行一段時間后, 各菌種之間相互影響, 不存在較明顯的優(yōu)勢菌種, 各菌種的占比相差不大.空間上從下至上分別取樣品2、3、4, 從相對豐度比例>1%的菌種來看, 樣品2、3、4中屬于水解發(fā)酵菌群的相對豐度分別為11.75%、12.05%、11.57%, 屬于產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群的相對豐度分別為10.81%、11.64%、10.20%, 屬于產(chǎn)甲烷菌群的相對豐度分別為9.05%、7.26%、10.55%.從中可以看出, 水解發(fā)酵菌群相對較多, 其次是產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群, 產(chǎn)甲烷菌群相對最少, 但它們之間差距較小.造成這種趨勢的原因與厭氧消化過程密切相關(guān), 水解發(fā)酵菌群為產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群提供反應底物, 產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群為產(chǎn)甲烷菌群提供反應底物.因此, 在一個穩(wěn)定的系統(tǒng)內(nèi), 各類菌群的相對數(shù)量不會相差過大, 這也是該系統(tǒng)為何能達到90%以上COD去除率的原因之一.
樣品2、3、4在species水平上的多樣本比較Venn圖如圖 2所示.從圖 2中可以看出, 樣本2、3、4共有菌種8061種, 占據(jù)絕大多數(shù), 表明各樣本間的菌種沒有太大差別, 系統(tǒng)內(nèi)的菌群分布比較均勻, 幾乎不存在空間差異.這與AFMBR系統(tǒng)采用水流循環(huán)的形式, 使顆�；钚蕴砍浞至骰�, 加大了水與微生物之間的傳質(zhì)有關(guān), 從而促進了反應器的高效運行.
圖 2
圖 2樣品2、3、4在species水平上的多樣本比較Venn圖
3.4 基因的KEGG功能注釋
KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是有關(guān)生物系統(tǒng)較完善的數(shù)據(jù)庫, 整合了基因組、化學物質(zhì)和系統(tǒng)功能信息.其中, KEGG GENES搜集了所有已知的完整的基因組的基因蛋白序列, 包含每個基因的最低限度信息.KEGG Pathway存儲了各種生物學通路信息, 包括代謝通路、合成通路、膜轉(zhuǎn)運、信號傳遞、細胞周期及疾病相關(guān)通路等.樣品2、3、4的KEGG Pathway基因豐度統(tǒng)計如表 9所示.Pathway Level1的Metabolism中, 基因豐度最高的是Overview, 其次依次分別為Carbohydrate metabolism、Amino acid metabolism和Energy metabolism.其中, Carbohydrate metabolism為碳水化合物代謝, 樣品2、3、4的相對豐度分別為5.62%、5.74%、5.47%;Amino acid metabolism為氨基酸代謝, 樣品2、3、4的相對豐度分別為5.62%、5.64%、5.48%.這與本次實驗用水水質(zhì)有關(guān), 實驗廢水中的有機物分別為蔗糖和蛋白胨, 因此, 針對這兩部分的功能基因數(shù)目較多, 較為活躍.關(guān)于Energy metabolism, 樣品2、3、4的相對豐度分別為4.90%、4.72%、4.78%, 其中大部分功能基因與厭氧消化菌群中產(chǎn)甲烷菌的產(chǎn)甲烷過程有關(guān), 這使得反應器有較高的甲烷產(chǎn)率及COD去除率.
表 9 KEGG Pathway Metabolism基因豐度統(tǒng)計
樣品2、3、4的Pathway Level 3分類統(tǒng)計柱狀圖如圖 3所示.從圖 3中可以看出, ko01230、ko01200的基因豐度明顯高于其他類別, 其中, ko01230(Biosynthesis of amino acids)為氨基酸的生物合成, 樣品2、3、4的相對豐度分別為3.78%、3.71%、3.67%;ko01200(Carbon metabolism)為碳代謝, 樣品2、3、4的相對豐度分別為3.72%、3.64%、3.63%.ko01230、ko01200均屬于Pathway Level2中的Overview.此外, 圖 3中ko00680(Methane metabolism)為甲烷代謝, 樣品2、3、4的相對豐度分別為1.72%、1.54%、1.73%.
圖 3
圖 3樣品2、3、4的Pathway Level3分類統(tǒng)計柱狀圖
甲烷代謝過程中的產(chǎn)甲烷途徑有4種, 分別是二氧化碳轉(zhuǎn)化為甲烷、甲醇轉(zhuǎn)化為甲烷、乙酸轉(zhuǎn)化為甲烷及甲胺/二甲胺/三甲胺轉(zhuǎn)化為甲烷.樣品中各產(chǎn)甲烷途徑的基因相對豐度如表 10所示.從表 10中可以看出, 二氧化碳轉(zhuǎn)化為甲烷、乙酸轉(zhuǎn)化為甲烷的基因豐度相對較高, 是系統(tǒng)產(chǎn)甲烷的主要途徑;其次, 甲醇轉(zhuǎn)化為甲烷、甲胺/二甲胺/三甲胺轉(zhuǎn)化為甲烷的基因豐度也占有較大比例, 也是系統(tǒng)產(chǎn)甲烷過程的重要組分.
表 10 樣品中各產(chǎn)甲烷途徑的基因相對豐度
4 結(jié)論(Conclusions)
1) 與接種菌群相比, AFMBR運行一段時間后微生物的優(yōu)勢菌屬發(fā)生了較大的變化.其中, 細菌優(yōu)勢菌屬由接種時的Petrimonas轉(zhuǎn)變?yōu)锽acteria_noname(未命名的細菌菌屬), 古菌菌屬由接種時的甲烷囊菌屬轉(zhuǎn)變?yōu)榧淄榘睡B球菌屬和甲烷桿菌屬, 可以推測產(chǎn)甲烷基質(zhì)由最初的氫氣為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜釣橹?
2) AFMBR運行一段時間后, 從相對豐度≥1%的菌種來看, 其中, 水解發(fā)酵菌群的相對豐度最高, 其次為產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群, 產(chǎn)甲烷菌群相對最少, 但各菌群之間相對豐度的差距較小.
3) AFMBR運行一段時間后, 系統(tǒng)內(nèi)的菌群分布比較均勻, 空間上不存在明顯的菌群結(jié)構(gòu)差異.這與AFMBR系統(tǒng)采用水流循環(huán)的形式, 使顆�；钚蕴砍浞至骰�, 加大了水與微生物之間的傳質(zhì)有關(guān).
4) AFMBR系統(tǒng)內(nèi)與代謝通路相關(guān)的碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝基因豐度較高.二氧化碳轉(zhuǎn)化為甲烷、乙酸轉(zhuǎn)化為甲烷是系統(tǒng)產(chǎn)甲烷的主要途徑.此外, 甲醇轉(zhuǎn)化為甲烷、甲胺/二甲胺/三甲胺轉(zhuǎn)化為甲烷也是系統(tǒng)產(chǎn)甲烷過程的重要組分.(來源：環(huán)境科學學報 作者：陳昌明)
