目前，高鹽廢水是水處理領(lǐng)域的一大難點(diǎn)，電滲析、焚燒法、膜分離法、蒸汽壓縮法等均有一定的處理效果.但此類方法的投資運(yùn)行費(fèi)用較高，易造成二次污染而難以在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中推廣應(yīng)用.生化法因處理費(fèi)用較低、應(yīng)用范圍廣且不易造成二次污染而被廣泛利用.常用的生物法包括傳統(tǒng)活性污泥法、SBR法、MBR法、好氧顆粒污泥法以及厭氧生物處理法等.系統(tǒng)中適量的無(wú)機(jī)鹽不僅促進(jìn)微生物生長(zhǎng)過(guò)程中的酶反應(yīng)，還能夠維持膜平衡、調(diào)節(jié)滲透壓.但鹽度一旦過(guò)量，就會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)起到抑制作用，甚至?xí)率刮⑸锼劳�，其主要原因在于：廢水鹽度較高時(shí)會(huì)使微生物的滲透壓升高，使微生物脫水導(dǎo)致細(xì)胞原生質(zhì)分離;鹽度較高時(shí)會(huì)使細(xì)胞脫氫酶的活性降低;廢水中的Cl-會(huì)對(duì)微生物有毒害作用，甚至?xí)䴕⑺牢⑸?使得水的密度增加，造成活性污泥上浮而流失.
國(guó)內(nèi)外很多研究表明，生物法可以高效地處理高鹽度廢水.但隨著系統(tǒng)鹽度的增加，微生物需要一段時(shí)間的適應(yīng)過(guò)程.系統(tǒng)鹽度的變化會(huì)引起微生物代謝途徑的變化以及微生物群落的顯著變化.本文通過(guò)逐漸提高系統(tǒng)的鹽度，探究不同鹽度下活性污泥的性質(zhì)以及微生物群落的變化，并測(cè)定不同鹽度下活性污泥中微生物的脂肪酸和DNA，對(duì)處理實(shí)際的含鹽廢水有較大的意義.
1 材料與方法1.1 污泥來(lái)源與試驗(yàn)材料1.1.1 污泥來(lái)源
試驗(yàn)選取青島李村河生活污水處理廠二沉池污泥，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)活性污泥進(jìn)行觀察，視野中觀察到變形蟲、草履蟲等微型后生動(dòng)物、原生動(dòng)物等，表明現(xiàn)階段污泥的活性較高.
1.1.2 主要試劑和試驗(yàn)儀器
氯化鈉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸銨、乙酸、氫氧化鉀、納米四氧化三鐵、甲基叔丁基醚以及測(cè)定氨氮的相關(guān)試劑等. COD測(cè)定儀、可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、脂肪酸鑒定系統(tǒng)等.
1.2 耐鹽菌的馴化
試驗(yàn)選取李村河污水處理廠二沉池污泥，按污泥:水=1:1的比例配成12 L活性污泥溶液于容器中，每日投加碳源、氮源、磷源分別為：葡萄糖12 g，硫酸銨1.42 g，磷酸二氫鉀0.344 g.間歇曝氣，每4 h一個(gè)周期，曝氣3 h，停歇1 h.每天換水一次，投加無(wú)碘鹽逐步提高系統(tǒng)的鹽度，使其鹽度從最開(kāi)始的0，逐漸提升至0.5%、1%、1.5%、2%.每個(gè)鹽度下分別對(duì)活性污泥的活性和降解COD、NH4+-N性能進(jìn)行測(cè)定，探索不同鹽度下活性污泥的污泥體積指數(shù)SVI的變化規(guī)律，同時(shí)提取出污泥中微生物的脂肪酸進(jìn)行分析，得出耐鹽馴化過(guò)程中活性污泥系統(tǒng)微生物菌群的變化.
1.3 微生物脂肪酸的提取、分析
依據(jù)微生物脂肪酸的提取步驟，提取所需微生物的脂肪酸，運(yùn)用MIDI-Sherlock全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌群的鑒定分析.
1.4 高效降解含鹽結(jié)晶紫廢水活性污泥的馴化
取結(jié)晶紫粉末于3L燒杯中加蒸餾水，制成2 500 mL質(zhì)量濃度為5 mg·L-1的模擬染料廢水.最初向燒杯中加入50 mL 5 mg·L-1的結(jié)晶紫廢水，燒杯中加入500 mL活性污泥溶液，加水定容至3 000 mL，曝氣馴化培養(yǎng)一周，然后每周逐漸多加200 mL結(jié)晶紫廢水，共馴化10周，得到可以高效降解含鹽結(jié)晶紫廢水的活性污泥.
1.5 四氧化三鐵磁納米粒子(MNPs)馴化含鹽結(jié)晶紫廢水中的活性污泥
將馴化好的500 mL活性污泥放入3 000 mL燒杯中，加入2 500 mL質(zhì)量濃度為5 mg·L-1的模擬染料廢水，再向燒杯中加入0.57 g四氧化三鐵磁納米粒子(MNPs)，攪拌，曝氣培養(yǎng)8周，即得到試驗(yàn)所需微生物，用于后續(xù)的DNA測(cè)序分析.
1.6 微生物DNA的提取、分析
本試驗(yàn)采用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒直接提取活性污泥中微生物的DNA，得到高品質(zhì)的DNA可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用高通量測(cè)序技術(shù)，研究不同鹽度下微生物群落的變化情況.
PCR儀：ABI GeneAmp® 9700.
測(cè)序平臺(tái)：采用Illumina MiSeq/HiSeq測(cè)序平臺(tái)，不同樣品的Tags和OTU數(shù)目統(tǒng)計(jì)，OUT豐度聚類圖，為了研究樣品的物種組成及多樣性信息，對(duì)所有樣品的全部Effective Tags序列進(jìn)行聚類(默認(rèn)選取Identity為97%)，形成OTU.
2 結(jié)果與討論2.1 不同鹽度下活性污泥對(duì)廢水COD、NH4+-N的降解
馴化初期系統(tǒng)鹽度為0%，由于污泥在容器中處于缺氧環(huán)境，活性較差COD去除率僅為55%左右. a階段(0~20 d)是系統(tǒng)在鹽度為0條件下的污泥馴化階段，20 d時(shí)COD和NH4+-N的去除率分別提高至80%和71%;b階段(20~50 d)是系統(tǒng)在鹽度為0.5%條件下的污泥馴化階段，COD、NH4+-N降解效率先下降后升高，馴化30 d后，COD和NH4+-N的去除率可提高到90%和78%;50d開(kāi)始將系統(tǒng)的鹽度提高到1%，此時(shí)進(jìn)入c階段(50~120 d)，馴化至120 d時(shí)污泥COD去除率達(dá)85%以上，NH4+-N的去除率在80%左右;120 d后進(jìn)入d階段，此時(shí)系統(tǒng)的鹽度為1.5%，此鹽度下馴化維持60 d，COD去除率達(dá)到78%左右，NH4+-N去除率75%;180 d繼續(xù)提高系統(tǒng)鹽度至2%，系統(tǒng)進(jìn)入e階段(180~300 d)，COD、NH4+-N的降解效率下降明顯，190 d時(shí)，COD去除率低至60.5%，NH4+-N去除率56%，保持鹽度2%繼續(xù)馴化，最終在300 d時(shí)測(cè)得COD去除率為80%左右，NH4+-N去除率75%，達(dá)到預(yù)期處理效果，如圖 1所示.
圖 1 COD、NH4+-N降解趨勢(shì)
系統(tǒng)鹽度每提高一次，污泥對(duì)有機(jī)物和氨氮的去除效率總是先下降后逐漸恢復(fù)的趨勢(shì).鹽度提高，微生物細(xì)胞的滲透壓增高，細(xì)胞脫氫酶的活性降低，導(dǎo)致活性污泥系統(tǒng)受到?jīng)_擊，部分微生物由于無(wú)法適應(yīng)高鹽環(huán)境，甚至出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，使得處理效果減弱，表現(xiàn)為COD、NH4+-N的去除率下降.隨著長(zhǎng)時(shí)間的不斷馴化，系統(tǒng)抗鹽度沖擊的能力逐漸增強(qiáng)，適應(yīng)高鹽環(huán)境的微生物群落開(kāi)始不斷生長(zhǎng)繁殖，對(duì)COD、NH4+-N的降解效率提高.
2.2 不同鹽度下活性污泥SVI值的變化
由表 1和圖 2可知，隨著鹽度的增加，接種時(shí)活性污泥的濃度為3.50 g·L-1，經(jīng)過(guò)300 d馴化后，在系統(tǒng)2%的條件下，活性污泥的濃度增加到7.52 g·L-1，而活性污泥的污泥體積指數(shù)SVI值不斷減小.在無(wú)鹽的環(huán)境中，污泥的SVI值在89 mL·g-1，在鹽度0.5%的環(huán)境中，污泥的SVI值下降到53 mL·g-1，隨著鹽度的不斷增加，當(dāng)鹽度為2%時(shí)，污泥的SVI值不足35 mL·g-1.隨著鹽度增加，活性污泥SVI值降低，可能是由于：高鹽環(huán)境下微生物的生長(zhǎng)和生物活性均受到抑制，微生物從絮凝體上脫落上浮水中，無(wú)法沉降;鹽度的沖擊改變了污泥的生態(tài)環(huán)境，游離原生微型后生動(dòng)物的捕食受到影響而死亡，污泥沉降性減弱;高鹽沖擊使微生物生理活動(dòng)受阻，胞外分泌物減少，污泥的絮凝性能下降.而有研究認(rèn)為高鹽環(huán)境下，微生物為了生存聚集在一起，通過(guò)自身調(diào)節(jié)使胞外多聚物的分泌增加，既可以抵御鹽度的毒害又增加了絮凝性能，表現(xiàn)為絮體顆粒變大密實(shí)，改善了沉降性能.
表 1 各鹽度下活性污泥SV、MLSS、SVI的變化
圖 2 各鹽度下SVI值
2.3 不同鹽度下活性污泥中微生物的脂肪酸分析
利用MIDI-Sherlock全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)各個(gè)鹽度所提取出的脂肪酸進(jìn)行分析，得到各種脂肪酸分布圖譜.將5個(gè)鹽度下脂肪酸鑒定圖譜中各菌群所占含量用Origin軟件處理并整理得到圖 3.
圖 3 對(duì)應(yīng)鹽度下各菌群所占百分比
從活性污泥微生物的組成來(lái)看，主要由AM菌、革蘭氏陰性菌、真核生物、放線菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和厭氧菌等組成.隨著鹽度的升高，革蘭氏陽(yáng)性菌數(shù)量表現(xiàn)為先增加后減小，其中在鹽度為1%時(shí)含量最高，為47%，整個(gè)鹽度梯度革蘭氏陽(yáng)性菌含量均維持在35%以上;而革蘭氏陰性菌所占百分比隨著鹽度的增加，表現(xiàn)出明顯下降的趨勢(shì)，從百分含量45%左右減小到10%左右;真菌和放線菌隨著鹽度的升高百分含量均有一定程度上增加，其中真菌的增加幅度較為明顯，從5%左右升高到30%，放線菌百分含量由5%增加到15%左右;圖 3中看出真核生物的百分含量隨鹽度變化不大，在5%左右波動(dòng);AM菌和厭氧菌在活性污泥微生物群落中所占比例很小，約為5%，隨著鹽度的增加，百分含量下降，鹽度1%以上百分含量基本為0%.
革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁較厚，肽聚糖含量豐富，并且含有大量的磷壁酸，這種結(jié)構(gòu)使其可以抵抗較高的鹽度沖擊，因此革蘭氏陽(yáng)性菌是每個(gè)對(duì)應(yīng)鹽度下的優(yōu)勢(shì)菌種;革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁以及肽聚糖膜要比革蘭氏陽(yáng)性菌要薄得多，因此隨著鹽度的增加，革蘭氏陰性菌越來(lái)越少;真菌和放線菌中含有大量的累積相容性物質(zhì)，如糖類、醇類、脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等，可大大提高耐鹽性，使其隨著鹽度的增加含量逐漸增大.因此，隨著不斷的馴化，污泥在高鹽環(huán)境中的活性良好，可高效地處理廢水.
2.4 模擬染料廢水降解趨勢(shì)
向馴化好的活性污泥中加入質(zhì)量濃度為5 mg·L-1的結(jié)晶紫染料廢水，曝氣培養(yǎng)，每隔12 h取樣一次，并于紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)上進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，掃描出的數(shù)據(jù)用Origin軟件繪圖，結(jié)果如圖 4.從中可以看出，結(jié)晶紫在582 nm處有最大吸收峰，在301 nm處有吸收峰. 0 h最大吸收峰處的吸光度值為1.136，12 h最大吸收峰處的吸光度值為0.791，24 h最大吸收峰處的吸光度值為0.274，分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出結(jié)晶紫的濃度分別為5、3.45、1.16mg·L-1.可以直觀地看出結(jié)晶紫濃度隨時(shí)間逐漸降低，驗(yàn)證了經(jīng)高鹽結(jié)晶紫模擬廢水馴化的活性污泥對(duì)結(jié)晶紫具有顯著的降解能力.
圖 4 結(jié)晶紫吸收峰變化
2.5 16S rDNA測(cè)序分析結(jié)果
對(duì)耐鹽馴化階段的活性污泥(鹽度分別為0.5%、1%、1.5%、2%)以及高鹽結(jié)晶紫染料馴化階段的污泥和MNPs馴化出的功能微生物進(jìn)行DNA提取并對(duì)提取出的DNA進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析.
DNA檢測(cè)合格后(濃度>ng·μL-1)，用一對(duì)特異性引物(515F、806R)對(duì)16S rDNA的V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖 5.從中可以看出PCR擴(kuò)增的條帶清晰，大小合適，產(chǎn)物純度較高，且無(wú)雜帶，可以進(jìn)行DNA測(cè)序分析.
圖 5 活性污泥細(xì)菌16S rDNA基因的PCR產(chǎn)物
由圖 6可以看出樣品A-0.5、A-1、A-1.5、A-2中OUT數(shù)目分別為600、300、420、160，隨著鹽度的不斷增加，微生物群落的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，致使微生物的多樣性逐漸降低.圖 7中橫向?yàn)闃悠沸畔ⅲv向?yàn)镺TU ID，其中左側(cè)的聚類樹(shù)為OTU的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系及其物種注釋，分支的顏色表示OTU所在的屬(右邊的圖例)，上方的聚類樹(shù)為樣品聚類樹(shù)，中間的熱圖是OTU的相對(duì)豐度熱圖，顏色與相對(duì)豐度的關(guān)系見(jiàn)圖 7中的刻度尺.從中可以看出，隨著鹽度的不斷增加，酸胞菌屬(Acidocella)、麗水菌屬(Winogradskyella)、產(chǎn)黃桿菌(Rhodanobacter)、紅菌(Parvibaculum)含量均有不同程度的升高，并且產(chǎn)黃桿菌(Rhodanobacter)成為優(yōu)勢(shì)菌種;而變形菌屬(Dechloromonas)、黃色單胞菌(Dokdonella)、硝化螺菌屬(Nitrospira)、海藻球菌屬(Phycicoccus)含量呈下降趨勢(shì)，體現(xiàn)了微生物群落隨系統(tǒng)的鹽度逐步演變的過(guò)程.
樣品編號(hào)A-0.5、A-1、A-1.5、A-2、B-2、C-2分別對(duì)應(yīng)鹽度為0.5%、1%、1.5%、2%活性污泥樣品、結(jié)晶紫馴化活性污泥樣品和MNPs馴化出的功能微生物樣品，下同
圖 6 不同樣品的Tags和OTU數(shù)目統(tǒng)計(jì)
圖 7 OUT豐度聚類圖
將樣品B-2(鹽度2%的條件下加入結(jié)晶紫染料的活性污泥樣品)與A-2(鹽度2%的活性污泥樣品)對(duì)比發(fā)現(xiàn)：紅細(xì)菌屬(Parvibaculum)、麗水菌屬(Winogradskyella)含量有所增加，而產(chǎn)黃桿菌(Rhodanobacter)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)含量降低，說(shuō)明紅細(xì)菌屬(Parvibaculum)、麗水菌屬(Winogradskyella)能以結(jié)晶紫染料為能源物質(zhì)，將其分解為其他小分子物質(zhì)，一方面用于自身的生長(zhǎng)代謝，另一方面用于細(xì)胞的增殖，使得菌屬的含量升高;結(jié)晶紫染料不能作為能源物質(zhì)被產(chǎn)黃桿菌(Rhodanobacter)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)所利用，致使沒(méi)有可以維持其自身生長(zhǎng)代謝的物質(zhì)，從而使得該菌屬的數(shù)量不斷降低.
將樣品C-2(加入MNPs的結(jié)晶紫-活性污泥樣品)與樣品B-2對(duì)比可以看出：酸胞菌屬(Acidocella)、產(chǎn)黃桿菌(Rhodanobacter)含量增加，其原因是由于加入的MNPs有效地提高了污泥抗有毒有害物質(zhì)沖擊的能力，并且MNPs可作為微生物生長(zhǎng)棲息的載體，提高了酸胞菌屬(Acidocella)、產(chǎn)黃桿菌(Rhodanobacter)的生物活性，便于其生長(zhǎng)繁殖，使其含量增加;紅細(xì)菌屬(Parvibaculum)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)含量減小，可能由于MNPs的加入改變菌屬的生物磁場(chǎng)以及四氧化三鐵對(duì)該菌屬的微毒性，影響其新陳代謝等生命活動(dòng)，導(dǎo)致數(shù)量下降.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
3 結(jié)論
(1) 系統(tǒng)的鹽度顯著影響活性污泥的活性和沉降性能，隨著鹽度的增加，系統(tǒng)對(duì)廢水COD、NH4+-N的去除率以及SVI值均有所降低.經(jīng)過(guò)一定時(shí)間馴化后，在系統(tǒng)鹽度在2%的條件下，COD和NH4+-N的去除率基本穩(wěn)定在80%和75%左右，SVI值從開(kāi)始的89 mL·g-1下降到34 mL·g-1.
(2) 隨著系統(tǒng)鹽度的增加，革蘭氏陰性菌優(yōu)勢(shì)菌種的位置逐漸被真菌和放線菌取代，而革蘭氏陽(yáng)性菌依然為優(yōu)勢(shì)菌種;鹽度對(duì)真核生物的生長(zhǎng)影響不大，對(duì)AM菌和厭氧菌起到抑制作用.
(3) 馴化后的活性污泥可較好的處理含鹽結(jié)晶紫廢水，經(jīng)24 h生化處理，結(jié)晶紫廢水的降解率可達(dá)76.8%.
(4) 隨著鹽度的增加微生物的多樣性逐漸減少，其中酸胞菌屬、麗水菌屬、產(chǎn)黃桿菌、紅菌含量升高，產(chǎn)黃桿菌成為優(yōu)勢(shì)菌種，變形菌屬、黃色單胞菌、硝化螺菌屬含量下降.
(5) 加入結(jié)晶紫染料的活性污泥中紅細(xì)菌屬、麗水菌屬含量有所增加，產(chǎn)黃桿菌、農(nóng)桿菌屬含量減小.加入MNPs的結(jié)晶紫-活性污泥中酸胞菌屬、產(chǎn)黃桿菌含量增加，紅細(xì)菌屬、農(nóng)桿菌屬含量減小.
