隨著水體中氮素污染日益嚴(yán)重，已經(jīng)影響到了人類(lèi)健康，我國(guó)控制N、P的排放也越來(lái)越嚴(yán)格.新的排放標(biāo)準(zhǔn)對(duì)脫氮工藝提出了更高的要求，傳統(tǒng)脫氮工藝已無(wú)法滿(mǎn)足可持續(xù)發(fā)展的要求，經(jīng)濟(jì)高效的新型脫氮工藝亟需開(kāi)發(fā).厭氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, ANAMMOX)反應(yīng)是指在厭氧或缺氧條件下，厭氧氨氧化微生物以NO2--N為受體，氧化NH4+-N為氮?dú)獾倪^(guò)程，憑借工藝流程簡(jiǎn)短、無(wú)需外加有機(jī)碳源、曝氣能耗低、污泥產(chǎn)量低等優(yōu)勢(shì)，成為污水生物脫氮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究開(kāi)發(fā)了多種以厭氧氨氧化為主體的污水處理工藝，其中最為廣泛的為亞硝化-厭氧氨氧化工藝(Sharon-ANAMMOX).該工藝在亞硝化階段將原廢水中50%~60%的NH4+-N轉(zhuǎn)化為NO2--N，在ANAMMOX階段，ANAMMOX菌將剩余的NH4+-N與在亞硝化生成的NO2--N進(jìn)行厭氧氨氧化反應(yīng)生成氮?dú)?
目前亞硝化-厭氧氨氧化工藝已在高氨氮廢水領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，而在低氨氮廢水處理領(lǐng)域的應(yīng)用尚不成熟.本課題組基于前期的研究成果，構(gòu)建連續(xù)流完全混合反應(yīng)器(CSTR)亞硝化-膜生物反應(yīng)器(MBR)厭氧氨氧化系統(tǒng)，且為減少有機(jī)碳源對(duì)亞硝化及厭氧氨氧化的影響，在CSTR-MBR前端設(shè)置ABR除碳系統(tǒng)，將三者耦合成一體化ABR除碳-CSTR亞硝化-MBR厭氧氨氧化工藝處理生活污水，同時(shí)采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)系統(tǒng)內(nèi)微生物進(jìn)行檢測(cè)，從分子生物學(xué)角度分析菌群結(jié)構(gòu)變化，以期為ABR除碳-亞硝化-厭氧氨氧化工藝處理城市生活污水提供宏觀和微觀依據(jù).
1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)裝置
本實(shí)驗(yàn)裝置由有機(jī)玻璃制成，如圖 1，總有效體積16.24 L，反應(yīng)器長(zhǎng)63 cm，寬8 cm，有效高度30 cm，由ABR除碳系統(tǒng)、CSTR亞硝化和MBR厭氧氨氧化系統(tǒng)組成. ABR系統(tǒng)每隔室升流區(qū)和降流區(qū)隔間寬度比為4:1，折流板導(dǎo)向角為45℃，有效容積為8.8 L.亞硝化系統(tǒng)為連續(xù)流完全混合式反應(yīng)器，分為曝氣池和沉淀池兩部分組成，有效容積分別為2.64 L和0.96 L.厭氧氨氧化反應(yīng)器中設(shè)置簾式中空纖維微濾膜組件，膜孔徑0.1 μm，膜面積為0.2 m2，有效容積為3.84 L. MBR厭氧氨氧化進(jìn)水由ABR除碳系統(tǒng)出水和亞硝化出水兩部分組成，以此保證厭氧氨氧化進(jìn)水NH4+-N:NO2--N濃度在1:1左右.一體式反應(yīng)器通過(guò)蠕動(dòng)泵連續(xù)進(jìn)水，由蠕動(dòng)泵經(jīng)中空纖維微濾膜間歇抽吸出水，抽吸周期為10 min(8 min抽吸和2 min反沖洗).整個(gè)反應(yīng)器始終置于恒溫水浴箱中，溫度控制在(30±1)℃.
圖 1
1.2 接種污泥和實(shí)驗(yàn)進(jìn)水
ABR除碳污泥取自蘇州某生活污水處理廠缺氧池污泥，ABR反應(yīng)器各隔室接種污泥約占各隔室容積的2/3，污泥濃度(MLSS)為7.9 g·L-1.亞硝化污泥和厭氧氨氧化污泥均來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室的亞硝化反應(yīng)器和厭氧氨氧化反應(yīng)器，MLSS分別為4.5 g·L-1和6.9 g·L-1.
采用人工配水模擬城市污水，以(NH4)2SO4為氮源(NH4+-N濃度為50 mg·L-1左右)，以乙酸鈉為碳源(COD濃度為300~400 mg·L-1)，加碳酸氫鈉以調(diào)節(jié)pH至7.5左右.另外還包括生物所需的其他營(yíng)養(yǎng)元素氯化鈣(10 mg·L-1)、硫酸鎂(10 mg·L-1)、磷酸氫二鉀(4 mg·L-1 )及微量元素.微量元素分為微量元素Ⅰ和微量元素Ⅱ，微量元素按照1 mL·L-1添加.微量元素Ⅰ組分(g·L-1)：EDTA 5，F(xiàn)eSO4 5;微量元素Ⅱ組分(g·L-1)：EDTA 15，ZnSO4·7H2O 0.43，CoCl2·6H2O 0.24，MnCl2·4H2O 0.99，CuSO4·5H2O 0.25，NaMoO4·2H2O 0.22，NiCl2·6H2O 0.19，NaSeO4·10H2O 0.21，H3BO40.014.
1.3 分析方法
本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每隔1 d取水樣測(cè)定，測(cè)定項(xiàng)目主要包括：NH4+-N;納氏試劑分光光度法;NO2--N:N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;NO3--N：紫外分光光度法;MLSS、MLVSS：標(biāo)準(zhǔn)重量法;SVI：30 min沉降法;pH：pHS-9V數(shù)顯酸度計(jì);溶解氧：YSI550A溶氧儀.
1.4 微生物高通量測(cè)序分析
分別將實(shí)驗(yàn)前后的CANON系統(tǒng)中污泥采集送樣，采用FastPrep DNA提取試劑盒(QBIOGENE，USA)DNA，完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA.用16S rRNA基因引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR儀采用ABI GeneAmp®9700型，采用TransGen AP221-02;TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反應(yīng)體系.反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，27個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min，每個(gè)樣品重復(fù)3次.
使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的高通量測(cè)序，微生物多樣性分析于上海美吉醫(yī)藥生物科技有限公司所提供的I-Sanger生信分析云平臺(tái)上完成.
2 結(jié)果與討論2.1 亞硝化系統(tǒng)
因?yàn)閰捬醢毖趸磻?yīng)的基質(zhì)配比NH4+-N:NO2--N濃度為1:1左右，所以亞硝化和厭氧氨氧化的聯(lián)合工藝的關(guān)鍵在于如何實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的部分亞硝化，而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的部分亞硝化十分困難.本實(shí)驗(yàn)廢水先經(jīng)ABR除碳系統(tǒng)除碳后，一部分ABR除碳出水進(jìn)入亞硝化進(jìn)行完全亞硝化，另一部分ABR出水直接進(jìn)入?yún)捬醢毖趸到y(tǒng)中與亞硝化出水合并作為厭氧氨氧化進(jìn)水，工藝路線如圖 2.本工藝路線同樣可以保證厭氧氨氧化的進(jìn)水中NH4+-N和NO2--N濃度比為1:1，而控制完全亞硝化比部分亞硝化要容易得多.
圖 2
在ABR除碳-亞硝化耦合厭氧氨氧化一體式工藝啟動(dòng)過(guò)程中，人工模擬城市污水，控制一體式反應(yīng)器進(jìn)水COD濃度300~400 mg·L-1、NH4+-N濃度50 mg·L-1、pH值7.5左右，一體式反應(yīng)器HRT 18 h.此時(shí)ABR除碳系統(tǒng)出水COD濃度為120 mg·L-1，不會(huì)對(duì)后續(xù)亞硝化系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響[13, 14].如圖 3，控制亞硝化系統(tǒng)HRT為3 h、DO濃度為0.8~1.2 mg·L-1，亞硝化系統(tǒng)出水NH4+-N濃度在前5d后迅速降低至10 mg·L-1以下，這與李田等[15]接種儲(chǔ)存亞硝化污泥實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，出水NO2--N逐步由20 mg·L-1以下提升至35 mg·L-1左右，出水NO3--N濃度始終在6 mg·L-1以下，出水COD濃度在40 mg·L-1左右.在接下來(lái)的70 d的一體式反應(yīng)器啟動(dòng)過(guò)程中，亞硝化系統(tǒng)出水NH4+-N濃度維持在6~10 mg·L-1，氨氮去除率在80%~90%，氨氮去除率并未進(jìn)一步提高，是因?yàn)镹H4+-N出水濃度過(guò)低，會(huì)降低亞硝化系統(tǒng)中游離氨(free ammonia，F(xiàn)A)濃度.有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A對(duì)氨氧化細(xì)菌(ammonia oxidizing bacteria, AOB)和亞硝酸鹽氧化菌(nitrite oxidizing bacteria, NOB)產(chǎn)生抑制的濃度分別為10~150 mg·L-1和0.1~1.0 mg·L-1，本實(shí)驗(yàn)亞硝化系統(tǒng)出水NH4+-N濃度維持在6~10 mg·L-1，F(xiàn)A濃度控制在2~10 mg·L-1，這也是本實(shí)驗(yàn)亞硝化系統(tǒng)出水NO3--N較低的原因之一，亞硝累計(jì)率(NAR)在85%~93%.
圖 3
值得一提的是，在亞硝化系統(tǒng)的整個(gè)啟動(dòng)過(guò)程中，始終有10%~15%的氮損存在，這是因?yàn)閬喯趸磻?yīng)器存在局部死區(qū)，造成局部厭氧環(huán)境，且亞硝化系統(tǒng)中同時(shí)有氨氮和亞硝態(tài)氮的存在，為厭氧氨氧化菌的生存提供了條件，發(fā)生了厭氧氨氧化反應(yīng)，故而出現(xiàn)氮損的現(xiàn)象.在啟動(dòng)的前5 d，甚至出現(xiàn)了出水總氮大于進(jìn)水總氮的現(xiàn)象，這是由于部分接種的亞硝化污泥，不能適應(yīng)所在環(huán)境的改變而發(fā)生細(xì)胞自溶，釋放出大量的NH4+-N.具體聯(lián)系污水寶或參見(jiàn)http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
2.2 厭氧氨氧化系統(tǒng)
厭氧氨氧化系統(tǒng)的進(jìn)水由亞硝化系統(tǒng)出水和ABR除碳系統(tǒng)出水兩部分組成，在一體式反應(yīng)器啟動(dòng)的前37 d中，控制亞硝化系統(tǒng)出水和ABR除碳系統(tǒng)出水比例為(1.5:1)、厭氧氨氧化系統(tǒng)HRT 4.5 h，如圖 4，此時(shí)厭氧氨氧化系統(tǒng)出水即一體式ABR除碳-亞硝化-厭氧氨氧化反應(yīng)器出水NH4+-N呈現(xiàn)先下降后上升的變化，出水NO2--N一直處于較低水平(1~3 mg·L-1).這是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)厭氧氨氧化系統(tǒng)中接種的是培養(yǎng)成熟的厭氧氨氧化污泥，污泥活性良好，故接種后一體式反應(yīng)器出現(xiàn)出水NH4+-N濃度迅速下降的現(xiàn)象;而ABR除碳系統(tǒng)出水中NH4+-N濃度為50 mg·L-1，NO2--N濃度為0 mg·L-1，而厭氧氨氧化系統(tǒng)進(jìn)水中雖然亞硝化出水所占比例為ABR除碳系統(tǒng)的1.5倍，但是亞硝化出水中NO2--N濃度只有35 mg·L-1左右，且還存在6~10 mg·L-1左右的NH4+-N，經(jīng)計(jì)算此時(shí)厭氧氨氧化進(jìn)水中NO2--N:NH4+-N濃度為0.6~0.8:1，而目前，學(xué)術(shù)界普遍接受的厭氧氨氧化反應(yīng)方程式如式(1)所示.從中可知，該反應(yīng)NO2--N和NH4+-N消耗量的理論比為1.32:1，而本實(shí)驗(yàn)厭氧氨氧化系統(tǒng)進(jìn)水中NO2--N濃度所占比例較小，ANAMMOX菌長(zhǎng)期得不到均衡的基質(zhì)，故而出水NH4+-N濃度又出現(xiàn)上升的現(xiàn)象.
圖 4
在一體式反應(yīng)器運(yùn)行37 d后，將厭氧氨氧化系統(tǒng)進(jìn)水比例中亞硝化系統(tǒng)出水:ABR除碳系統(tǒng)出水(1.5:1)調(diào)整為2:1.經(jīng)計(jì)算，此時(shí)厭氧氨氧化系統(tǒng)進(jìn)水NO2--N:NH4+-N濃度為1:1左右，基本滿(mǎn)足厭氧氨氧化反應(yīng)所需基質(zhì)，在之后40 d的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行中，厭氧氨氧化系統(tǒng)出水即一體式反應(yīng)器出水NH4+-N、NO2--N濃度穩(wěn)定在3 mg·L-1以下，出水NO3--N濃度在4 mg·L-1左右，總氮去除率在86%~92%.
此外，如圖 5，厭氧氨氧化系統(tǒng)進(jìn)水經(jīng)亞硝化系統(tǒng)出水和ABR除碳系統(tǒng)出水混合后COD濃度在60~80 mg·L-1，出水COD濃度在20~40 mg·L-1，有機(jī)物并未對(duì)厭氧氨氧化產(chǎn)生不良影響.近年來(lái)，研究者在有機(jī)物對(duì)ANAMMOX影響方面展開(kāi)了大量研究，150 mg·L-1以下有機(jī)物濃度可使異養(yǎng)菌與ANAMMOX菌共存，并達(dá)到相互促進(jìn)的作用，這也是本實(shí)驗(yàn)厭氧氨氧化系統(tǒng)能夠穩(wěn)定運(yùn)行的原因.
圖 5
2.3 微生物菌群結(jié)構(gòu)變化
利用MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)實(shí)驗(yàn)前后亞硝化系統(tǒng)和厭氧氨氧化系統(tǒng)污泥中微生物多樣性進(jìn)行分析，本次研究中4個(gè)樣品的覆蓋度均大于99.99%，可確保本次測(cè)序結(jié)果能夠代表樣本中微生物群落組成.如表 1所示，ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)表征菌群豐度[24]，實(shí)驗(yàn)后亞硝化系統(tǒng)和厭氧氨氧化系統(tǒng)的Chao1和ACE指數(shù)均有所增加，表明實(shí)驗(yàn)后亞硝化系統(tǒng)和厭氧氨氧化系統(tǒng)均擁有更高的微生物物種豐度. Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表征菌群多樣性，Shannon值越大則表征微生物菌群組成復(fù)雜程度越高，亞硝化系統(tǒng)和厭氧氨氧化系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)后Shannon指數(shù)均略有增加，是因?yàn)樵谝惑w式ABR除碳-亞硝化-厭氧氨氧化反應(yīng)器啟動(dòng)過(guò)程中，前置系統(tǒng)中有部分微生物隨水流至下一系統(tǒng)中，從而造成微生物組成復(fù)雜程度變高.而Simpson指數(shù)表征微生物多樣性，Simpson指數(shù)越大，則表明優(yōu)勢(shì)菌群占微生物量的比重越大，反應(yīng)器性能提升的重要原因是反應(yīng)器中功能菌群不斷淘汰弱勢(shì)菌群成為反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì)菌群，實(shí)驗(yàn)后亞硝化系統(tǒng)和厭氧氨氧化系統(tǒng)Simpson指數(shù)均得到提升，這也從微生物角度表征了亞硝化系統(tǒng)和厭氧氨氧化系統(tǒng)功能得到提升.
表 1 實(shí)驗(yàn)前后微生物多樣性變化
圖 6為亞硝化系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)前后各菌群在綱水平上的相對(duì)豐度，從中可以看出γ-Protebacteria綱得到顯著提升，而Protebacteria門(mén)幾乎涵蓋了所有類(lèi)型的AOB，且γ-Protebacteria綱包含兼具呼吸、發(fā)酵代謝方式的兼性異養(yǎng)菌，它們是COD降解的主要參與者，這也從微生物角度解釋了亞硝化系統(tǒng)降解COD的原理，且γ-Protebacteria綱與反硝化密切相關(guān)，反硝化菌消耗有機(jī)物將亞硝化系統(tǒng)中NO2--N、NO3--N氧化為N2，這也解釋了亞硝化系統(tǒng)中存在氮損的原因. Sphingobacteria(鞘脂桿菌綱)數(shù)量有所減少，Sphingobacteria綱與分泌EPS有關(guān)，這可能與亞硝化污泥接種前后生存環(huán)境變化有關(guān)，接種前亞硝化污泥所在種泥反應(yīng)器更容易形成顆粒狀，而顆粒污泥與EPS密切相關(guān)，故Sphingobacteria綱在實(shí)驗(yàn)后有所減少.
圖 6
如圖 7，厭氧氨氧化系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)前后主要菌群均為Anaerolineae(厭氧繩菌綱)、norank_p_WWE3、β-Proteobacteria和Sphingobacteria綱. Anaerolineae綱是厭氧生物反應(yīng)器中常見(jiàn)的微生物菌群，對(duì)比實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)后厭氧氨氧化系統(tǒng)中Sphingobacteria綱有顯著增加，有研究表明[27]Sphingobacteria綱具有提高微生物生長(zhǎng)速率和脫氮速率的功能，故從微生物角度解釋了實(shí)驗(yàn)后厭氧氨氧化系統(tǒng)脫氮性能提高的原因.
圖 7
3 結(jié)論
(1) 控制亞硝化系統(tǒng)HRT為3h、DO為0.8~1.2 mg·L-1，F(xiàn)A濃度2~10 mg·L-1，亞硝化系統(tǒng)出水NH4+-N濃度6~10 mg·L-1，氨氮去除率80%~90%，NAR 85%~93%，出水COD濃度在40 mg·L-1左右，不會(huì)對(duì)后續(xù)ANAMMOX系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響.
(2) 控制亞硝化系統(tǒng)出水和ABR除碳出水比例為2:1作為厭氧氨氧化系統(tǒng)進(jìn)水，滿(mǎn)足ANAMMOX所需NO2--N和NH4+-N基質(zhì)比1:1左右.一體式反應(yīng)器出水NH4+-N、NO2--N濃度穩(wěn)定在3 mg·L-1以下，出水NO3--N濃度在4 mg·L-1左右，出水COD濃度在20~40 mg·L-1，總氮去除率在86%~92%，COD去除率85%以上，ABR除碳-亞硝化耦合厭氧氨氧化工藝能夠有效用于處理城市污水脫氮除碳.
(3) 實(shí)驗(yàn)后，亞硝化系統(tǒng)和厭氧氨氧化系統(tǒng)均擁有更高的微生物物種豐度，亞硝化系統(tǒng)中與反硝化密切相關(guān)的γ-Protebacteria綱有所增加，厭氧氨氧化系統(tǒng)中具有較高微生物生長(zhǎng)速率和增強(qiáng)脫氮速率功能的Sphingobacteria綱顯著增加，從微生物角度解釋了實(shí)驗(yàn)后一體式反應(yīng)器脫氮性能提高的原因.(來(lái)源：環(huán)境科學(xué) 作者：李田)
