高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于污水處理廠細(xì)菌氣溶膠群落結(jié)構(gòu)分析

　　1 引言(Introduction)

　　微生物氣溶膠在自然環(huán)境中普遍存在(Després et al., 2012;房文艷等, 2015;方治國(guó)等, 2005).通常, 微生物氣溶膠含有細(xì)菌和真菌等微生物粒子, 按其種類(lèi)被分為細(xì)菌氣溶膠和真菌氣溶膠.細(xì)菌氣溶膠粒徑范圍為0.5~100 μm, 芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、葡萄球菌(Staphylococcus)等為常見(jiàn)的細(xì)菌種類(lèi)(于璽華, 2002).有研究證實(shí), 污水處理過(guò)程有微生物氣溶膠的產(chǎn)生和逸散(劉建偉等, 2013;Han et al., 2013;Brandi et al., 2000;Li et al., 2013).由于污水及其處理設(shè)施中的微生物以細(xì)菌為主, 因此, 污水處理廠微生物氣溶膠的研究對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為關(guān)注, 特別是污水中存在病原菌和潛在致病細(xì)菌.因此, 要解析污水處理廠微生物氣溶膠中細(xì)菌群落多樣性, 選擇適宜的采樣和分析方法是關(guān)鍵.

　　根據(jù)采樣器的原理, 微生物氣溶膠采樣方法分為自然沉降法、射流撞擊式采樣法、離心式采樣法、過(guò)濾式采樣法和靜電沉降式采樣法(于璽華, 2002;李濤, 2003).其中, 固體多級(jí)撞擊式的Andersen采樣器具有操作簡(jiǎn)便、采樣效率高、微生物存活率高等優(yōu)點(diǎn), 通常作為可培養(yǎng)微生物氣溶膠采集的標(biāo)準(zhǔn)方法被廣泛應(yīng)用(Xu et al., 2013).此外, 過(guò)濾式采樣法具有抽氣設(shè)備流量大、收集效率高等優(yōu)點(diǎn), 其中, 大流量的總懸浮顆粒物采樣器常應(yīng)用于基于非培養(yǎng)法的微生物氣溶膠分子生物學(xué)研究(Cao et al., 2014).在分析方法方面, 傳統(tǒng)的培養(yǎng)法在研究微生物氣溶膠的微生物多樣性方面存在局限性, 只能檢測(cè)可培養(yǎng)微生物, 其數(shù)量不到微生物總數(shù)的10%(Dong et al., 2016;Urbano et al., 2011).近年來(lái), 隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展, 空氣微生物群落的解析方法也從培養(yǎng)法向非培養(yǎng)法發(fā)展(方治國(guó)等, 2016).16S rDNA克隆文庫(kù)技術(shù)(Urbano et al., 2011;Han et al., 2012)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性凝膠梯度電泳(Polymerase chain reaction- denatured gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)(Xu et al., 2013)、基因芯片技術(shù)(Peccia et al., 2006;方治國(guó)等, 2016)、末端限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(Terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)(方治國(guó)等, 2016)、熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization, FISH)(Lange et al., 1997)、定量PCR技術(shù)(Wery et al., 2008;Yamamoto et al., 2014)和空氣微生物宏基因組學(xué)(Cao et al., 2014;Yamamoto et al., 2014;Dannemiller et al., 2014)等技術(shù)在環(huán)境細(xì)菌氣溶膠和真菌氣溶膠的群落組成鑒定、豐度的確定、對(duì)特異性的致病細(xì)菌或病毒的定量檢測(cè)中已有應(yīng)用.此外, 指紋圖譜技術(shù)、核酸雜交技術(shù)及高通量測(cè)序技術(shù)可以直接在分子水平上全面分析復(fù)雜環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性(Cao et al., 2014;Kumaraswamy et al., 2014).但如何解析污水處理廠細(xì)菌氣溶膠目前尚沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)方法.

　　本研究以某城市污水處理廠為研究對(duì)象, 以收集氣溶膠中全部細(xì)菌效率最高的總懸浮顆粒物采樣器進(jìn)行樣品收集, 并利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品中全部細(xì)菌的多樣性與群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析.作為對(duì)照, 同步采用收集氣溶膠中可培養(yǎng)細(xì)菌效率最高、應(yīng)用最廣泛的Andersen六級(jí)采樣器采樣, 用克隆文庫(kù)技術(shù)進(jìn)行分析, 以對(duì)比高通量測(cè)序與傳統(tǒng)的培養(yǎng)法對(duì)同一采樣點(diǎn)細(xì)菌氣溶膠解析的異同, 為確定適宜污水處理廠細(xì)菌氣溶膠的分析方法提供科學(xué)依據(jù).

　　2 材料與方法(Materials and methods)2.1 采樣點(diǎn)

　　細(xì)菌氣溶膠樣品采自某城市污水處理廠, 該污水處理廠采用SBR工藝處理生活污水, 規(guī)模為5.0×104 m3·d-1.細(xì)菌氣溶膠采樣點(diǎn)沿污水處理工藝布置, 包括細(xì)格柵、粗格柵、沉砂池、SBR池和污泥脫水間.另外, 選取污水處理廠外的上風(fēng)向200 m和下風(fēng)向200 m處作為對(duì)照點(diǎn).采樣高度設(shè)置距地面1.5 m處(人呼吸高度).

　　2.2 采樣方法

　　總懸浮顆粒物采樣器：采用智能中流量便攜式總懸浮顆粒物采樣器(TH-150C, 武漢天虹儀表有限責(zé)任公司), 采樣膜為直徑90 mm的石英濾膜(PALL, NY, U.S.), 其對(duì)顆粒物的截留率為99.9%, 采樣流量為100 L·min-1, 采樣時(shí)間不低于4 h.不同采樣點(diǎn)的細(xì)菌氣溶膠樣品同步采集.采樣完畢, 用無(wú)菌鑷子取出采樣膜, 保存在無(wú)菌錫箔紙內(nèi), 盡快轉(zhuǎn)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室立即處理, 或者凍存于-80 ℃冰箱內(nèi).

　　Andersen采樣器：采用Andersen六級(jí)固體撞擊式采樣器(228-9530 K, SKC Gulf Coast Inc., USA), 由六級(jí)帶有微小噴孔的鋁合金圓盤(pán)撞擊器組成, 每級(jí)撞擊器有400個(gè)孔, 孔的直徑逐漸縮小, 模擬人體呼吸道的解剖結(jié)構(gòu)和空氣動(dòng)力學(xué)特征, 采用慣性撞擊原理將空氣中懸浮的微生物粒子按照粒徑大小分等級(jí)地收集到采樣載體表面, 圓盤(pán)下方放盛有采樣介質(zhì)的培養(yǎng)皿, 本研究選取直徑為90 mm的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板(02-275, 北京奧博興生物技術(shù)有限責(zé)任公司)作為細(xì)菌氣溶膠分級(jí)截留介質(zhì), 設(shè)置抽氣速率為28.3 L·min-1, 樣品采集時(shí)間為3 min, 采集過(guò)程中設(shè)置3個(gè)平行.

　　2.3 分析方法2.3.1 DNA提取

　　總懸浮顆粒物中全細(xì)菌DNA提�。涸跓o(wú)菌條件下, 將總懸浮顆粒物采樣器收集在石英濾膜上的顆粒物樣品剪碎, 用40 mL無(wú)菌1×PBS緩沖液洗脫顆粒物, 置于4 ℃低溫低速離心機(jī)中, 200 g離心2 h.通過(guò)真空過(guò)濾裝置, 將上述離心后的緩沖液濃縮顆粒物至聚醚砜濾膜(PES)上, 剪碎此濾膜立即加入到MO-BIO PowerSoil DNA試劑盒(Carlsbad, CA, U.S.)中的PowerBead Tube中, 按參考文獻(xiàn)報(bào)道的優(yōu)化提取方法提取DNA(Jiang et al., 2015).

　　可培養(yǎng)細(xì)菌DNA提�。和ㄟ^(guò)Andersen采樣器收集細(xì)菌培養(yǎng)基上的顆粒物, 30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后, 使用1×PBS緩沖液收集所有細(xì)菌培養(yǎng)物, 采用核酸自動(dòng)提取儀(TanBead, 臺(tái)灣)對(duì)細(xì)菌總DNA進(jìn)行提取.

　　2.3.2 總懸浮顆粒物樣品的高通量測(cè)序與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

　　總懸浮顆粒物中全部細(xì)菌的DNA測(cè)序所用擴(kuò)增引物為V3+V4區(qū)338F/806R(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′/5′GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3);PCR擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 27個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;最后保持在10 ℃直到取出樣品.擴(kuò)增產(chǎn)物采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 使用AxyPrep DNA凝膠抽提試劑盒(AXYGEN)對(duì)PCR產(chǎn)物切膠純化回收.

　　DNA序列通過(guò)Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序, 按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行操作分類(lèi)單元OTU(operational taxonomic units)聚類(lèi), 在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體, 得到OTU的代表序列.為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息, 采用Ribosomal Database Project(RDP) Classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析, 并分別在門(mén)(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)不同分類(lèi)水平下統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成.

　　2.3.3 可培養(yǎng)細(xì)菌克隆文庫(kù)的構(gòu)建與多樣性分析

　　可培養(yǎng)細(xì)菌DNA產(chǎn)物經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后構(gòu)建克隆文庫(kù), 所用引物及擴(kuò)增程序、覆蓋度和多樣性的計(jì)算參考本課題組前期報(bào)道(Han et al., 2013), 其中, 覆蓋度C的計(jì)算方法如式(1)所示, C值≥75%方可認(rèn)為挑取的克隆數(shù)足以反映真實(shí)的群落結(jié)構(gòu), C值越高, 表明挑取的克隆對(duì)真實(shí)群落的覆蓋程度越高.

　　(1)

　　式中, N為16S rDNA克隆文庫(kù)的庫(kù)容, 即挑取的陽(yáng)性克隆總數(shù)目;n1為16S rDNA克隆文庫(kù)中僅出現(xiàn)一次的克隆.

　　多樣性以Shannon-Wiener指數(shù)進(jìn)行評(píng)估, 計(jì)算方法如式(2)所示：

　　(2)

　　式中, Pi為第i個(gè)OTU在克隆文庫(kù)庫(kù)容中所占的比例, 本研究中在相似度≥97%分類(lèi)水平下劃分OTU, OTU越多表明鑒定的細(xì)菌種類(lèi)越多;S為克隆文庫(kù)中OTU的總數(shù)目.

　　3 結(jié)果與分析(Results and analysis)3.1 細(xì)菌氣溶膠豐富度和多樣性分析

　　分別對(duì)污水廠不同采樣點(diǎn)樣品的克隆文庫(kù)和高通量測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 結(jié)果見(jiàn)圖 1.通過(guò)克隆文庫(kù)挑取的陽(yáng)性克隆數(shù)范圍為43~107個(gè), 劃分的OTUs個(gè)數(shù)為11~37個(gè);高通量測(cè)序技術(shù)獲得的序列數(shù)范圍為23656~42383個(gè), 劃分的OTUs個(gè)數(shù)為1212~1638個(gè).基于克隆文庫(kù)技術(shù)用某一陽(yáng)性克隆的序列來(lái)代表某一物種、高通量測(cè)序技術(shù)用某一序列代表某一物種的原理, 顯而易見(jiàn), 各采樣點(diǎn)用“總懸浮顆粒物采樣器+高通量測(cè)序技術(shù)”檢測(cè)出的物種數(shù)量均遠(yuǎn)多于用“Andersen六級(jí)采樣器+克隆文庫(kù)技術(shù)”檢測(cè)出的物種數(shù)量, 表明高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)于細(xì)菌氣溶膠群落結(jié)構(gòu)豐富度的表征具有優(yōu)勢(shì).

　　圖 1

　　圖 1 16S rDNA克隆文庫(kù)(a)和高通量測(cè)序技術(shù)(b)分析細(xì)菌氣溶膠獲取的測(cè)序信息

　　進(jìn)一步對(duì)上述測(cè)序結(jié)果做細(xì)菌群落組成覆蓋度的評(píng)價(jià), 結(jié)果如圖 2所示.克隆文庫(kù)技術(shù)對(duì)污水處理廠不同采樣點(diǎn)氣溶膠中細(xì)菌的覆蓋度范圍為77.50%~90.40%, 不同采樣點(diǎn)氣溶膠中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的覆蓋度差別較大;而高通量測(cè)序?qū)λ�有�?xì)菌氣溶膠的覆蓋度均大于99%.上述結(jié)果表明, 盡管克隆文庫(kù)技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)在呈現(xiàn)氣溶膠中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)覆蓋度方面均達(dá)到了實(shí)驗(yàn)理論的標(biāo)準(zhǔn)要求, 但高通量測(cè)序技術(shù)在呈現(xiàn)群落結(jié)構(gòu)覆蓋度的穩(wěn)定性和全面性方面顯著優(yōu)于克隆文庫(kù)技術(shù).

　　圖 2

　　圖 2通過(guò)16S rDNA克隆文庫(kù)和高通量測(cè)序技術(shù)分析細(xì)菌氣溶膠群落結(jié)構(gòu)的覆蓋度

　　對(duì)各采樣點(diǎn)氣溶膠樣品中的細(xì)菌多樣性(屬分類(lèi)水平)進(jìn)行分析, 結(jié)果見(jiàn)圖 3.依據(jù)式(2)計(jì)算的氣溶膠中的細(xì)菌Shannon-Wiener指數(shù)表明, 克隆文庫(kù)分析可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性指數(shù)為0.58(粗格柵)~2.37(污泥脫水間), 而通過(guò)高通量測(cè)序?qū)θ�部�?xì)菌多樣性指數(shù)的分析結(jié)果為5.06(細(xì)格柵)~5.99(污泥脫水間).高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到的各采樣點(diǎn)氣溶膠中的細(xì)菌多樣性均遠(yuǎn)高于克隆文庫(kù)檢測(cè)到的結(jié)果.具體聯(lián)系污水寶或參見(jiàn)http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　圖 3

　　圖 3通過(guò)16S rDNA克隆文庫(kù)和高通量測(cè)序技術(shù)分析細(xì)菌氣溶膠的Shannon-Wiener指數(shù)

　　3.2 細(xì)菌氣溶膠群落結(jié)構(gòu)的解析

　　在門(mén)、綱、目、科和屬5種分類(lèi)水平下, 分別對(duì)污水處理廠各采樣點(diǎn)的細(xì)菌氣溶膠克隆文庫(kù)和高通量測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表 1), 結(jié)果表明, 無(wú)論在何種分類(lèi)水平下, 高通量測(cè)序?qū)τ跉馊苣z中的細(xì)菌群落組成的解析更全面.

　　表 1 克隆文庫(kù)和高通量測(cè)序?qū)��?xì)菌氣溶膠在不同分類(lèi)水平的對(duì)比

 　　圖 4展示的是在門(mén)分類(lèi)水平下, “總懸浮顆粒物采樣器+高通量測(cè)序技術(shù)”和“Andersen六級(jí)采樣器+克隆文庫(kù)技術(shù)”對(duì)細(xì)菌氣溶膠群落組成的解析結(jié)果.在所有采樣點(diǎn)的細(xì)菌氣溶膠中, 克隆文庫(kù)僅檢測(cè)到厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)3種細(xì)菌門(mén)類(lèi), 其中前兩者為主要的細(xì)菌門(mén)類(lèi)(圖 4a), 同時(shí), 這兩種菌門(mén)在不同采樣點(diǎn)的分布差別較大, 例如, 厚壁菌門(mén)在粗格柵(90.0%)、細(xì)格柵(92.2%)和沉砂池(78.9%)的占比較高, 而變形菌門(mén)在曝氣池水面(62.1%)和污泥脫水間(74.4%)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén).

　　圖 4

　　圖 4通過(guò)16S rDNA克隆文庫(kù)(a)和高通量測(cè)序技術(shù)(b)分析細(xì)菌氣溶膠在門(mén)類(lèi)水平的群落結(jié)構(gòu)

　　高通量測(cè)序獲得的細(xì)菌門(mén)類(lèi)共有34個(gè)(表 1), 其中, 豐度≥1%的有11個(gè), 其100%地覆蓋了克隆文庫(kù)測(cè)得的3種優(yōu)勢(shì)菌門(mén).除此之外, 還特異地鑒定到包括擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes, 3.06%~13.48%)等在內(nèi)的其他優(yōu)勢(shì)菌門(mén), 總比例為72.1%~91.7%(圖 4b).

　　上述結(jié)果表明, 在門(mén)分類(lèi)水平下, 克隆文庫(kù)技術(shù)由于測(cè)序通量低和挑取陽(yáng)性克隆的隨機(jī)性等弊端(張玉等, 2018), 重復(fù)檢出厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)細(xì)菌, 高估了其在污水廠細(xì)菌氣溶膠中的占比, 而低估甚至忽略了包括擬桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)等在內(nèi)的其他細(xì)菌門(mén)類(lèi)的分布比例(圖 4b).高通量測(cè)序可一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定, 克服了克隆文庫(kù)測(cè)序的上述弊端, 可以更全面、客觀地對(duì)微生物群落多樣性進(jìn)行評(píng)估.

　　在屬分類(lèi)水平下, 利用克隆文庫(kù)分析技術(shù)檢測(cè)氣溶膠中的細(xì)菌群落組成如圖 5所示, 在鑒定到的31個(gè)細(xì)菌菌屬中(豐度均大于1%), 各個(gè)采樣點(diǎn)的群落組成差別較大, 例如, 芽孢桿菌屬(Bacillus)為所有采樣點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)菌屬, 其中, 在粗格柵和細(xì)格柵的細(xì)菌氣溶膠群落組成中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì), 分別占87.0%和74.8%, 而在曝氣池水面和污泥脫水間的比例分別為6.90%和15.0%;氣單胞菌屬(Aeromonas)為曝氣池水面處的優(yōu)勢(shì)菌屬(55.2%).導(dǎo)致不同采樣點(diǎn)氣溶膠中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的原因一方面是由于上述克隆文庫(kù)的技術(shù)弊端;另一方面與污水廠不同處理工段的構(gòu)筑物特點(diǎn)、污水處理設(shè)施等有關(guān), 例如, 本研究選取的這座污水廠的粗格柵和細(xì)格柵為室內(nèi)操作間, 其中, 粗格柵為地下7 m左右的操作間, 粗格柵和細(xì)格柵均不加蓋, 湍急的進(jìn)水將污水中大量的微生物釋放到空氣中形成氣溶膠, 在具有穩(wěn)定氣象條件的室內(nèi)環(huán)境中不斷累積, 導(dǎo)致其群落組成與設(shè)置于室外曝氣池處的氣溶膠中的細(xì)菌群落組成明顯不同.

　　圖 5

　　圖 5通過(guò)16S rDNA克隆文庫(kù)技術(shù)分析細(xì)菌氣溶膠在屬分類(lèi)水平的群落結(jié)構(gòu)

　　高通量測(cè)序技術(shù)共檢測(cè)到422個(gè)細(xì)菌菌屬(表 1), 其中豐度≥1%的共有79個(gè)(豐度小于1%的全部歸類(lèi)為Others)(圖 6).兩種測(cè)序技術(shù)共同鑒定到6個(gè)菌屬, 高通量測(cè)序技術(shù)特異地檢測(cè)到的細(xì)菌菌屬占83.3%~98.5%, 其對(duì)于群落多樣性的解析顯著優(yōu)于克隆文庫(kù)技術(shù).

　　圖 6

　　圖 6高通量測(cè)序技術(shù)分析細(xì)菌氣溶膠在屬分類(lèi)水平的群落結(jié)構(gòu)

　　值得一提的是, “總懸浮顆粒物采樣器+高通量測(cè)序技術(shù)”和“Andersen六級(jí)采樣器+克隆文庫(kù)技術(shù)”對(duì)同一采樣點(diǎn)細(xì)菌氣溶膠的全部細(xì)菌和可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)群落鑒定結(jié)果幾乎完全不同, 而高通量測(cè)序?qū)θ�部�?xì)菌群落結(jié)構(gòu)的解析更能證明污水廠不同采樣點(diǎn)細(xì)菌氣溶膠與其逸散源的關(guān)系, 例如, 在進(jìn)水段的粗格柵和細(xì)格柵處的優(yōu)勢(shì)菌屬為氣單胞菌屬(10.7%、12.5%)和消化鏈球菌屬(Peptostreptococcaceae_unclassified)(15.1%、11.1%), 前者普遍存在于淡水、淤泥和污水等環(huán)境中(Parker et al., 2011), 而后者常見(jiàn)于人和動(dòng)物的口腔、腸道和呼吸道, 在人類(lèi)女性泌尿生殖道也是正常的生理菌群, 污水廠的進(jìn)水作為收納這類(lèi)微生物的水體(Lu et al., 2015;Jiang et al., 2015), 進(jìn)水過(guò)程中的跌水等環(huán)節(jié)會(huì)將其釋放到周?chē)�的環(huán)境中(Brandi et al., 2000;Li et al., 2013);而污泥脫水間氣溶膠中7.1%的細(xì)菌隸屬于細(xì)菌菌膠團(tuán)(Zoogloea), Zoogloea為活性污泥的主體, 而本研究中污泥脫水間內(nèi)的污泥脫水機(jī)為離心式且為不加蓋的設(shè)備, 在脫水過(guò)程中會(huì)將活性污泥中的細(xì)菌直接釋放到周?chē)�空氣�?

　　上述結(jié)果表明, 細(xì)菌氣溶膠直接提取DNA并通過(guò)高通量測(cè)序?qū)��?xì)菌氣溶膠優(yōu)勢(shì)菌的解析, 更能說(shuō)明細(xì)菌氣溶膠與其釋放源的關(guān)聯(lián)性, 可更全面、真實(shí)地反映細(xì)菌氣溶膠的群落分布狀態(tài), 近幾年高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展, 為空氣微生物的宏基因組解析提供了操作簡(jiǎn)便、通量大、信息全面、經(jīng)濟(jì)適用的技術(shù)支持(Behzad et al., 2015), 但該分析方法由于讀長(zhǎng)較短, 對(duì)于準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌的種類(lèi)存在一定缺陷.而通過(guò)傳統(tǒng)的可培養(yǎng)法結(jié)合克隆文庫(kù)收集并解析細(xì)菌氣溶膠, 實(shí)際是選擇性地收集易于培養(yǎng)細(xì)菌的過(guò)程, 因而導(dǎo)致其分析結(jié)果具有較強(qiáng)的隨機(jī)性和較大偏差, 此外, 該法操作繁復(fù), 大批量、復(fù)雜空氣微生物的解析需大量的人力和高昂的費(fèi)用, 獲取的序列通量有限, 盡管如此, 16S rDNA克隆文庫(kù)作為一項(xiàng)成熟的測(cè)序技術(shù), 可操作性強(qiáng), 獲得的測(cè)序片段較長(zhǎng)(大約為1500 bp), 可以準(zhǔn)確地確定微生物的分類(lèi), 對(duì)微生物多樣性較低樣本的準(zhǔn)確鑒定依然適用.

　　4 結(jié)論(Conclusions)

　　通過(guò)總懸浮顆粒物采樣器收集污水處理全過(guò)程中的細(xì)菌氣溶膠, 并通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定, 結(jié)果表明, 相對(duì)于對(duì)照組采用Andersen采樣器的傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和克隆文庫(kù)分析方法, 前者特異地檢測(cè)到細(xì)菌氣溶膠中83.3%~98.5%的細(xì)菌菌屬, 氣溶膠中的多個(gè)細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬在污水、污泥中廣泛存在, 因此, 采用“總懸浮顆粒物采樣器+高通量測(cè)序技術(shù)”在解析污水處理廠氣溶膠中細(xì)菌多樣性、群落結(jié)構(gòu)覆蓋度、穩(wěn)定性和全面性方面具有明顯的優(yōu)勢(shì), 能客觀說(shuō)明細(xì)菌氣溶膠與其釋放源的關(guān)聯(lián)性, 全面和真實(shí)地反映細(xì)菌氣溶膠的群落分布狀態(tài).但該分析方法由于讀長(zhǎng)較短, 對(duì)于準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌的種類(lèi)尚存在一定缺陷.(來(lái)源：環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào) 作者：許光素)