探究升流式厭氧反應(yīng)器中Anammox菌活性恢復(fù)特性

　　1 引言(Introduction)

　　厭氧氨氧化(Anaerobic ammonium oxidizing, Anammox)工藝是在厭氧或缺氧條件下, 厭氧氨氧化菌利用NO2-為電子受體氧化NH4+為N2的一種化能自養(yǎng)型脫氮工藝(Wr et al., 2007).Anammox工藝因具有脫氮效率高、污泥產(chǎn)量低、無需外加碳源等優(yōu)勢而倍受歡迎, 已被用于實際工程中(Jin et al., 2012a;2012b;Zhang et al., 2013).但Anammox菌具有生長速率慢、倍增時間長、環(huán)境敏感度高等缺陷(Jin et al., 2012b;Wr et al., 2007), 增加了Anammox工藝受損后的恢復(fù)難度.實際廢水, 尤其是工業(yè)廢水中, 化學(xué)成分復(fù)雜(He et al., 2016;Li et al., 2017b;Zhang et al., 2013), 氮濃度較高, 其中的NO2--N和NH4+-N雖為Anammox菌的生長基質(zhì), 但同時也是毒性物質(zhì), 極易影響Anammox菌的生長代謝, 進而威脅Anammox工藝的運行(Li et al., 2017a;2012b).研究表明, NO2--N對Anammox工藝的影響高于NH4+-N(Puyol et al., 2014;Carvajalarroyo et al., 2015), NH4+-N濃度低于1000 mg · L -1時不會抑制Anammox菌活性, 而NO2--N濃度高于280 mg · L -1時便會產(chǎn)生抑制, 因此, 基質(zhì)抑制尤其是NO2--N抑制是Anammox工藝廣泛應(yīng)用的瓶頸之一(Dapena-Mora et al., 2007;Isaka et al., 2007;Wang et al., 2016;Strous, 1999).因此, 高濃度基質(zhì)抑制后Anammox菌的活性恢復(fù)及其恢復(fù)策略研究將有助于Anammox工藝的推廣應(yīng)用.

　　胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances, EPS)作為微生物新陳代謝和細胞自溶分泌的產(chǎn)物, 是一類附著于細胞壁表面的有機大分子多聚物, 主要由結(jié)合型EPS構(gòu)成, 其又分為緊密型(TB-EPS)和松散型(LB-EPS)兩種, 分別由內(nèi)到外包埋微生物, 以維持細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性(Badireddy et al., 2010;Sheng et al., 2010;Zhu et al., 2009).EPS主要由蛋白質(zhì)(Protein, PN)和多糖(Polysaccharide, PS)構(gòu)成, 其中, PS是由中性的和帶電的糖苷鍵構(gòu)成的異質(zhì)多糖體, 以各種結(jié)合力與基質(zhì)中的生物分子構(gòu)成EPS的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu), 而PN則包含有胞外酶、EPS修飾酶及結(jié)構(gòu)蛋白等, 被固定于PS中, 降解基質(zhì)中聚合物并修飾EPS結(jié)構(gòu), 二者相互作用以促進微生物間的物質(zhì)轉(zhuǎn)換和能量傳遞, 增強微生物的耐沖擊能力并維持其酶活性及功能特性(Flemming et al., 2010).PN和PS濃度易受水質(zhì)條件、反應(yīng)器運行方式及優(yōu)勢菌種代謝水平等因素的影響(Hou et al., 2015;Yin et al., 2015;Zhu et al., 2009), 可很好地反映Anammox菌的活性恢復(fù)情況.本研究通過考察受基質(zhì)抑制后的Anammox菌在活性恢復(fù)過程中, 其脫氮性能、EPS組分及Anammox菌豐度的變化, 探究升流式厭氧反應(yīng)器中Anammox菌的活性恢復(fù)特性, 以期為Anammox工藝恢復(fù)的機制研究及實際應(yīng)用提供理論與技術(shù)支持.

　　2 材料和方法(Materials and methods)2.1 試驗裝置

　　試驗采用升流式厭氧氨氧化反應(yīng)器, 具體如圖 1所示.反應(yīng)器制作材料為有機玻璃, 有效容積1.5 L, 頂部設(shè)有三相分離裝置和溢流堰, 處理水經(jīng)溢流堰排出, 反應(yīng)器內(nèi)部掛有辮簾式填料, 便于形成生物膜, 上部設(shè)有回流裝置(回流比為4), 促進反應(yīng)器內(nèi)部循環(huán), 并防止進水口堵塞.反應(yīng)器整體置于恒溫(35±2) ℃水浴箱中, 避光運行, 進水pH經(jīng)0.1 mol · L-1鹽酸調(diào)節(jié)至7.5左右, 維持Anammox菌適宜的生長環(huán)境.

　　圖 1

　　圖 1實驗裝置示意圖 

　　2.2 試驗條件和運行策略

　　試驗用水為人工配制的模擬廢水, 具體組成見表 1.其中, 微量元素成分為(g · L-1)：EDTA 20、ZnSO4 · 7H2O 0.43、CoCl2 · 6H2O 0.24、MnCl2 · 4H2O 0.99、CuSO4 · 5H2O 0.25、NaMoO4 · 2H2O 0.043、NiCl2 · 6H2O 0.20、KH2PO4 20、H3BO3 0.014.于進水桶和出水口處, 分別用離心管收集水樣, 經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后分別采用納氏試劑法、N-(1-萘基)乙二胺分光光度法和紫外分光光度法測定樣品中的NH4+-N、NO2--N和NO3--N (Hendrickx et al., 2014).pH采用便攜式pH計(FG2-FK, METTLER TOLEDO, USA)測定;污泥樣品MLSS、MLVSS均按(國家環(huán)境保護總局《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會, 2002)的標(biāo)準(zhǔn)方法測定.

　　本研究試驗前反應(yīng)器已穩(wěn)定運行1年, 填料中生長磚紅色生物膜, 游離的污泥呈紅色松散顆粒狀.在進水TN濃度(NH4+-N為350 mg · L-1, NO2--N為350 mg · L-1)為700 mg · L-1, HRT為9 h的條件下, 反應(yīng)器NH4+-N和NO2--N去除率穩(wěn)定在94%和83%左右.之后因中斷反應(yīng)器回流, 且仍以TN濃度700 mg · L-1的進水運行, 致使進水區(qū)域NO2--N濃度由回流時的20.92 mg · L-1劇增為320.24 mg · L-1, 引起基質(zhì)抑制, 反應(yīng)器于之后的1周內(nèi)脫氮性能驟降, NH4+-N和NO2--N去除率分別降至9.67%和8.75%, 泥色呈灰黑色, 略有臭味, 此時, 反應(yīng)器中MLSS為7.46 g · L-1, MLVSS為3.96 g · L-1.之后試驗采用階段式提高氮負荷的方法恢復(fù)反應(yīng)器中Anammox菌的活性, 分5個階段進行, TN濃度分別為160、320、500、700和1000 mg · L-1, 具體運行策略見表 2.

　　2.3 EPS提取及測定

　　污泥樣品中的EPS采用高速離心與超聲組合的方式提取(Yu et al., 2009), 即取適量4 ℃下靜置1.5 h的污泥, 經(jīng)緩沖液(Na3PO4 : NaH2PO4 : NaCl : KCl=2 : 4 : 9 : 1, pH=7.0)重懸至初始體積后, 4 ℃下2000 g離心15 min, 棄去上清液, 底部沉淀物再次重懸, 并離心(2000 g, 15 min), 此上清液即為LB-EPS;重復(fù)底部沉淀物的重懸步驟, 經(jīng)20 kHz、480 W超聲破碎儀(Scienta-IID, China)超聲10 min (工作1 s-停止2 s)后, 4 ℃下2000 g離心20 min, 上清液即為TB-EPS.LB-EPS和TB-EPS經(jīng)0.45 μm聚四氟乙烯濾膜過濾后進行蛋白質(zhì)與多糖的測定.EPS中蛋白質(zhì)采用BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010S, 碧云天, 中國)測定, 以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(歐清梅, 2015);多糖采用蒽酮-硫酸法測定, 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(張俊珂等, 2016).

　　2.4 DNA提取與實時定量PCR

　　稱取500 mg污泥樣品, 使用FastDNATM SPIN Kit for Soil(LLC, MP Biomedicals, USA)提取試劑盒按其操作步驟提取污泥樣品中總DNA.實時定量PCR實驗采用Roche LightCycler®480 Ⅱ(Roche Diagnostics Ltd, Rotkreuz, Swltzerland)實時熒光定量系統(tǒng)進行, 反應(yīng)采用20 μL體系, 具體配置為：SYBR Green Ⅰ Master(LightCycler®480, mannheim, Germany)10 μL, 前后引物各0.8 μL, 質(zhì)�；駾NA樣品1 μL, 去離子水7.4 μL.其中, 全細菌定量引物為通用引物341F:534R(Hou et al., 2014), 而Anammox菌采用特異性引物Amx808F(5′-ARC YGT AAA CGA TGG GCA CTA A-3′)和Amx1040R (5′-CAG CCA TGC AAC ACC TGT RAT A-3′) (Hou et al., 2014;Meng et al., 2010).實時定量PCR運行程序為三步法：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s, 45 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 35個循環(huán);72 ℃終延伸10 min, 最后進行溶解曲線分析.

　　3 結(jié)果與討論(Results and discussion)3.1 厭氧氨氧化反應(yīng)器活性恢復(fù)中脫氮性能變化

　　由反應(yīng)器進出水氮濃度(圖 2)和脫氮效率變化(圖 3a)可知, 活性恢復(fù)中隨著進水總氮濃度的階段性增加, 出水總氮濃度也逐漸增加, 以出水NO3--N濃度增加最為顯著, NO2--N次之; 而NH4+-N濃度始終保持在5 mg · L-1以下, 僅在進水氮濃度提高的48 h內(nèi), 出水NH4+-N濃度偏高, 但均會迅速趨于穩(wěn)定.反應(yīng)器的TN去除率在階段Ⅰ~Ⅱ逐漸增加, 最高可達91.74%, 在階段Ⅲ~Ⅴ則逐漸穩(wěn)定在78.8%左右.而NO2--N去除率相反, 在階段Ⅰ~Ⅱ穩(wěn)定于98%左右, 而階段Ⅲ~Ⅴ則逐漸下降, 階段Ⅴ去除率平均為83.8%.NH4+-N去除率相對穩(wěn)定, 始終維持在98%左右.

　　圖 2

　　圖 2活性恢復(fù)中反應(yīng)器進出水氮濃度變化

　　由圖 3b可知, 活性恢復(fù)階段Ⅰ~Ⅴ中, 氮去除負荷(Nitrogen Removal Rate, NRR)隨氮負荷率(Nitrogen Loading Rate, NLR)的增加而逐漸增加, 各階段NRR分別穩(wěn)定在0.21、0.64、1.05、1.55和2.21 kg · m-3 · d-1左右, 與Zhang等(2015)報道的重金屬銅抑制后Anammox工藝恢復(fù)狀況相近.因此, 階段式提高NLR可有效利用菌群的適應(yīng)性和競爭機制(Sheng et al., 2010), 利于Anammox活性的快速恢復(fù).

　　圖 3

　　圖 3厭氧氨氧化反應(yīng)器中脫氮效率(a)、氮負荷及去除的不同形式氮素比值(b)的變化

　　由圖 2和圖 3可知, 在活性恢復(fù)階段(Ⅰ~Ⅳ), 反應(yīng)器均可在提高NLR后的24 h內(nèi)快速適應(yīng)并穩(wěn)定運行, 截至階段Ⅳ, 反應(yīng)器已恢復(fù)至受損前的穩(wěn)定狀態(tài).其中, 階段Ⅱ第18 d時反應(yīng)器出現(xiàn)較大波動, 使整體脫氮效率呈現(xiàn)較低狀態(tài), 且ΔNO3--N/ΔNH4+-N值低于階段Ⅲ, 可能是因為HRT由12 h縮短至9 h導(dǎo)致的.而在階段Ⅴ中, NLR提高后反應(yīng)器需72 h方可漸漸適應(yīng), 且NH4+-N和NO2--N去除率分別較階段Ⅳ降低了2.44%和10.23%, 可能是高濃度的NO2--N對Anammox菌和異養(yǎng)菌有毒害作用, 細胞死亡自溶使反應(yīng)器內(nèi)源性COD增加(Tian et al., 2013), 增加了反硝化菌的競爭力.同時, 在進水NO2--N/NH4+-N為1.32的前提下, 盡管階段Ⅰ~Ⅴ的NH4+-N去除率均高于96%, 但NO2--N去除率和ΔNO3--N/ΔNH4+-N值卻逐漸下降, 且出水NO2--N濃度由起初的0.79 mg · L -1漸增至91.00 mg · L-1, 說明雖然有出水回流的稀釋作用, 會一定程度上緩解NO2--N對Anammox菌的毒害, 但高濃度NO2--N仍然會抑制Anammox菌活性(Fernández et al., 2012;Kimura et al., 2010;Tang et al., 2010).有研究指出, 當(dāng)NO2--N濃度超過750 mg L-1時, 90%的Anammox菌發(fā)生可逆性失活(Kimura et al., 2010).研究也表明, 瞬時1000 mg · L -1 TN(NH4+-N+NO2--N)的沖擊會引起50%Anammox菌失活(Lotti et al., 2012).

　　3.2 活性恢復(fù)階段厭氧氨氧化菌的EPS組分變化

　　由圖 4可知, 反應(yīng)器活性恢復(fù)中EPS含量隨NLR提高呈先下降后上升的趨勢, 階段Ⅰ~Ⅴ的EPS含量分別為150.56、33.51、8.42、10.05和10.21 mg · g-1(以VSS計), 各階段TB-EPS含量均高于LB-EPS含量, 且TB-EPS較LB-EPS對環(huán)境敏感度高, 其PN含量均高于PS含量, 這與Jia等(2017)和Pellicernàcher等(2013)的研究結(jié)果一致.階段Ⅰ~Ⅲ中, EPS含量逐漸下降, 階段Ⅰ中EPS含量遠高于階段Ⅱ和Ⅲ, 其TB-EPS約為LB-EPS的90.25倍, 且TB-PN/PS和LB-PN/PS值分別為21.02和2.21左右, 說明高濃度基質(zhì)沖擊時, 反應(yīng)器內(nèi)部分微生物發(fā)生了菌體自溶(Tian et al., 2013), 釋放出了細胞內(nèi)部的PN, 使TB-EPS中PN含量劇增, 而PN中荷負電氨基酸較多, 疏水性強(Raszka et al., 2010;Zhang et al., 2007), 利于絮體聚集, 加速了Anammox菌恢復(fù)穩(wěn)定, 同時, TB-EPS緊附于細胞壁上不易脫落(Li et al., 2007;Yang et al., 2009), 導(dǎo)致TB-EPS中PN滯留, 使階段Ⅰ的TB-EPS含量較高.具體聯(lián)系污水寶或參見http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　圖 4

　　圖 4活性恢復(fù)中反應(yīng)器內(nèi)EPS組分變化

　　階段Ⅰ~Ⅲ, TB-EPS和LB-EPS中PS含量逐漸增加, 易于形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu), 利于PN和PS的相互協(xié)作及細胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)換和能量傳遞, 同時, 增加Anammox菌和TB-EPS中EPS修飾酶活性, 使EPS分層更加趨于穩(wěn)定(Flemming et al., 2010).階段Ⅳ和Ⅴ, TB-PN/PS和LB-PN/PS值穩(wěn)定于0.84左右, 此結(jié)果與Jia等(2017)報道的Anammox菌穩(wěn)定時的結(jié)果相近, 說明Anammox系統(tǒng)已處于穩(wěn)態(tài).另外, 階段Ⅳ和Ⅴ中EPS含量較階段Ⅲ分別增加了19.36%和21.26%, 是因為TN濃度超過了Anammox菌的合適閾值使其產(chǎn)生一定程度的應(yīng)激性, 加速了EPS的分泌, 以增強對外界環(huán)境變化的耐受性(Hou et al., 2015;Neyens et al., 2004).

　　3.3 活性恢復(fù)階段Anammox菌的豐度變化

　　從圖 5中Anammox菌豐度變化可知, 反應(yīng)器活性恢復(fù)階段Ⅰ~Ⅴ中細菌總數(shù)逐漸上升, 而Anammox菌豐度為7.7×109~2.4×1010 copies · g-1(以VSS計), 介于高夢佳等(2016)和王衫允等(2016)報道的數(shù)據(jù)之間.Anammox菌的相對豐度與其絕對豐度變化趨勢相同, 階段Ⅰ~Ⅴ分別為7.78%、5.73%、4.14%、12.59%和7.46%.階段Ⅰ~Ⅲ中, Anammox菌豐度相當(dāng), 這說明中斷回流1周后Anammox菌數(shù)量并沒有顯著變化, 而其活性受損才是脫氮性能降低的主要原因.在階段Ⅳ中Anammox菌豐度最高, 為2.4×1010 copies · g-1(以VSS計), 這顯示Anammox菌重新適應(yīng)了反應(yīng)器的運行條件, 活性得到恢復(fù)(Ma et al., 2012;Molin et al., 2003).隨后的階段Ⅴ中, Anammox菌豐度略有下降, 可能與過高的進水NH4+-N和NO2--N濃度的抑制作用有關(guān)(Dapena-Mora et al., 2007;Isaka et al., 2007;Raudkivi et al., 2017;Strous et al., 1999;Yang et al., 2011).

　　圖 5

　　圖 5活性恢復(fù)中反應(yīng)器內(nèi)Anammox菌豐度變化

　　綜合反應(yīng)器活性恢復(fù)過程各階段的脫氮性能、EPS組分及Anammox菌豐度變化可知, 逐步提高氮負荷, 受損反應(yīng)器中Anammox菌的活性逐步恢復(fù).TN濃度為700 mg · L-1時, 脫氮效率和Anammox菌豐度較高, 且EPS組分含量適宜.而過高的TN濃度(1000 mg · L-1)條件下, 反應(yīng)器雖然仍有良好的脫氮效率, 但EPS組分含量及Anammox菌豐度均呈現(xiàn)一定程度惡化(Hou et al., 2015;Lotti et al., 2012), 隨著時間延長, 有可能導(dǎo)致其脫氮效率下降.

　　4 結(jié)論(Conclusions)

　　Anammox菌對廢水中氮濃度變化敏感.高于700 mg · L-1的TN濃度會導(dǎo)致Anammox菌產(chǎn)生基質(zhì)抑制, 使Anammox污泥中EPS、TB-PN/PS和LB-PN/PS顯著增高.采用階段式提高負荷有利于Anammox菌的活性恢復(fù), 最終平均氮去除負荷達2.21 kg · m-3 · d-1.TN濃度為700 mg · L-1時反應(yīng)器運行效果最佳, TN去除率最高為79.74%, 且Anammox菌豐度最高.(來源：環(huán)境科學(xué)學(xué)報 作者：楊瑞麗)