定向進(jìn)化提高染織廢水脫色效率

　　過(guò)氧化物酶是一類含血紅素的氧化還原酶，能夠以過(guò)氧化氫為電子受體氧化多種有機(jī)和無(wú)機(jī)分子，在免疫檢測(cè)、生物傳感器、工業(yè)廢水處理等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。目前使用的大多數(shù)過(guò)氧化物酶來(lái)源于植物，其生產(chǎn)受地域和氣候的限制，給工業(yè)應(yīng)用帶來(lái)不便。灰蓋鬼傘過(guò)氧化物酶因與辣根過(guò)氧化物酶在酶學(xué)特性和底物廣譜性上十分相似而引起了人們的廣泛關(guān)注，盡管二者同源性低于10%−16%。研究發(fā)現(xiàn)，CIP已經(jīng)成功用于清除廢水中的酚類物質(zhì)、降解苯類同系物及衍生物、染料脫色;生產(chǎn)功能性多聚芳香物;用作生物傳感器和清潔劑;此外，CIP在紙漿造紙工業(yè)也極具應(yīng)用潛力。從商業(yè)角度看，CIP有望替代HRP成為工業(yè)用酶，有著廣闊的市場(chǎng)前景。

　　近年來(lái)酶法處理染料廢水因條件溫和、環(huán)境友好而發(fā)展迅速，漆酶、過(guò)氧化物酶被廣泛試用于染料脫色。令人遺憾的是染織工業(yè)廢水pH大多是中性甚至堿性，漆酶和過(guò)氧化物酶卻多為酸性酶，在中堿性條件下會(huì)快速失活;而CIP的最適反應(yīng)pH接近中性，熱穩(wěn)定性比HRP更強(qiáng)，相對(duì)于其它酶CIP更適合用作染織業(yè)廢水脫色處理。美中不足的是灰蓋鬼傘屬于中溫菌，其產(chǎn)生的CIP在高溫和堿性環(huán)境下不夠穩(wěn)定。利用分子定向進(jìn)化技術(shù)進(jìn)行CIP酶學(xué)性質(zhì)的分子改良是改變最適反應(yīng)pH、提高酶的熱穩(wěn)定性和堿性環(huán)境耐受性的重要途徑Cherry等利用定向進(jìn)化技術(shù)得到了一個(gè)氧化穩(wěn)定性提高100倍、熱穩(wěn)定性提高174倍的突變CIP;Houborg等研究了該突變體酶的晶體結(jié)構(gòu)，揭示了蛋白結(jié)構(gòu)改變對(duì)酶學(xué)性質(zhì)的影響。但是該突變酶在高溫下仍不夠穩(wěn)定，40°C處理5min活性下降為87%。目前國(guó)際上尚沒(méi)有關(guān)于CIP的最適反應(yīng)pH向中、堿性方向偏移，最適反應(yīng)溫度大幅提高且高溫穩(wěn)定性增強(qiáng)的分子定向進(jìn)化研究。

　　Cherry等報(bào)道M166F和M242I能夠提高CIP的氧化穩(wěn)定性，V53A可以提高酶活性;Houborg等研究晶體結(jié)構(gòu)時(shí)提出I49S和V53A會(huì)協(xié)同發(fā)生作用。本文以含有4個(gè)氨基酸突變(I49S、V53A、M166F和M242I)的CIP基因?yàn)槟０澹�在保證了氧化穩(wěn)定性和提高酶活性的基礎(chǔ)上進(jìn)行基于易錯(cuò)PCR的定向進(jìn)化，以期尋找最適反應(yīng)pH向中、堿性方向偏移，最適反應(yīng)溫度升高，更適應(yīng)染料脫色處理的工業(yè)用CIP。

　　染料脫色實(shí)驗(yàn)

　　選pH2.2−8.0的檸檬酸-磷酸作緩沖液，分別用CIPwt和CIPmt5的粗酶液對(duì)7種染料進(jìn)行脫色能力測(cè)定。200mL反應(yīng)體系含合適初始濃度染料(剛果紅7.18mmol/L，氨基黑8.11mmol/L，甲基橙15.28mmol/L，次甲基藍(lán)14.98mmol/L，苯胺藍(lán)6.78mmol/L，結(jié)晶紫12.26mmol/L，溴酚藍(lán)7.46mmol/L)，雙氧水10mmol/L，CIPwt組酶用量為0.045U/mL，CIPmt5組酶用量為0.042U/mL，室溫(25°C)下孵育4h，測(cè)量脫色前后染料的濃度，

　　計(jì)算染料脫色率，計(jì)算公式如下：脫色率(%)=(脫色前吸光度–脫色后吸光度)/脫色前吸光度×100。

　　每個(gè)實(shí)驗(yàn)3個(gè)重復(fù)，剛果紅、氨基黑和甲基橙采用490nm波長(zhǎng)，次甲基藍(lán)和苯胺藍(lán)采用405nm波長(zhǎng)，結(jié)晶紫和溴酚藍(lán)采用630nm波長(zhǎng)，脫色率最高的緩沖液pH被認(rèn)定為最適pH。具體聯(lián)系污水寶或參見(jiàn)http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　討論

　　酵母在表達(dá)含稀有密碼子的外源基因時(shí)，細(xì)胞中氨酰tRNA對(duì)氨基酸的正常轉(zhuǎn)運(yùn)可能受到限制，致使翻譯提前終止。大量實(shí)驗(yàn)證明，密碼子優(yōu)化可以顯著提高蛋白在酵母中的表達(dá)[37,39]。在實(shí)驗(yàn)中將CIP密碼子調(diào)整為畢赤酵母偏好性，保證了突變CIP能夠在酵母中成功表達(dá)并完成表達(dá)后的翻譯、翻譯后加工、分泌等過(guò)程。根據(jù)Cherry等的報(bào)道向CIP中引入了4個(gè)氨基酸突變，為定向進(jìn)化奠定了基礎(chǔ)，使得到的酶有可能在最適反應(yīng)pH向中、堿性方向偏移，最適反應(yīng)溫度升高的同時(shí)保持氧化穩(wěn)定性。Cherry等對(duì)CIP進(jìn)行定向進(jìn)化時(shí)發(fā)現(xiàn)單個(gè)V53A可以提高酶活性，但不會(huì)引起穩(wěn)定性的改變，而M166F似乎和I49S、V53A協(xié)同發(fā)生作用，對(duì)穩(wěn)定性增強(qiáng)貢獻(xiàn)最大。用Swiss-model建模分析發(fā)現(xiàn)I49S、V53A導(dǎo)致酶蛋白缺失一個(gè)與原卟啉IX結(jié)合的氰根離子配體，使突變酶活性中心更開(kāi)放，所以表現(xiàn)出Km值下降，親和力增強(qiáng)。第49、53和121位的3個(gè)疏水性氨基酸同時(shí)變成親水性氨基酸，使蛋白側(cè)鏈變小，從而增加了蛋白的穩(wěn)定性。分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)一步驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。Cherry等分析E239G能夠改善CIP在高pH時(shí)的熱穩(wěn)定性，而本實(shí)驗(yàn)在定向進(jìn)化中得到了一個(gè)含有E239G的突變3-26-G5(I49S、V53A、M166F、E239G、M242I和Y272F)，最適反應(yīng)pH為6.5，酶活性是野生型的1.13倍(13.74U/mg)，最適反應(yīng)溫度為40°C，但是后期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其在各pH和溫度處理后穩(wěn)定性尚不如野生型(數(shù)據(jù)未顯示)。E239G的引入并沒(méi)有提高熱穩(wěn)定性，可能是各突變位點(diǎn)之間存在著復(fù)雜的相互作用，機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

　　染料廢水處理是環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域的一大難題，理化方法成本昂貴且會(huì)形成二次污染;酶法處理染料逐漸引起人們的重視。植物來(lái)源的過(guò)氧化物酶生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高不適合工業(yè)化應(yīng)用。而真菌來(lái)源的漆酶和過(guò)氧化物酶多為酸性酶，在中、堿性環(huán)境會(huì)快速失活。本實(shí)驗(yàn)用定向進(jìn)化的手法得到了酶學(xué)性質(zhì)顯著改善的突變灰蓋鬼傘過(guò)氧化物酶，并對(duì)不同類型的7種常用染織染料進(jìn)行脫色檢測(cè)。雖然CIPmt5可能會(huì)在較高溫度時(shí)(比如37°C和45°C)具有更高的活性和高的脫色效率，但考慮到室溫能耗低、利于降低處理成本，因此選擇了在室溫(25°C)下對(duì)染料進(jìn)行處理。因酶法脫色染料反應(yīng)體系和條件不同，無(wú)法與其他人的具體結(jié)果進(jìn)行比較，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看突變后的酶取得了比野生型酶更好的脫色效果，反應(yīng)條件更接近實(shí)際排放的染料工業(yè)廢水狀況，從方法的適應(yīng)性和節(jié)約成本出發(fā)，CIPmt5更適合染料工業(yè)廢水的處理應(yīng)用。