1 引言
酸雨是全球性三大主要環(huán)境污染之一，不僅能直接傷害農(nóng)作物，如抑制植物生長發(fā)育，降低產(chǎn)量與品質(zhì)，還能間接通過改變土壤性質(zhì)及影響土壤微生物活性并影響農(nóng)作物，已成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素.面對我國酸雨區(qū)面積不斷擴(kuò)大的嚴(yán)峻現(xiàn)實(shí)，減輕酸雨對植物的傷害已成為保障糧食安全的重要論題.有關(guān)稀土農(nóng)用的研究顯示，稀土可增強(qiáng)植物對冷凍、干旱、重金屬、紫外輻射、酸雨等脅迫因子的耐受能力，這與稀土增強(qiáng)植物光合作用，促進(jìn)營養(yǎng)吸收，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，以及提高抗氧化能力等有關(guān).質(zhì)膜H+-ATPase被譽(yù)為植物的主宰酶，參與轉(zhuǎn)運(yùn)胞內(nèi)H+和植物對逆境脅迫的響應(yīng).課題組前期研究顯示，酸雨脅迫會引起水稻葉片中質(zhì)膜H+-ATPase活性變化，在一定范圍能調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH，維持胞內(nèi)物質(zhì)穩(wěn)定，從而增強(qiáng)植物對酸雨脅迫的耐受性.那么稀土增強(qiáng)植物耐酸性是否與質(zhì)膜H+-ATPase活性變化有關(guān)?既然稀土能通過穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)來緩解非生物脅迫的傷害，且質(zhì)膜H+-ATPase活性又與質(zhì)膜環(huán)境密切相關(guān)，那么稀土對酸雨脅迫下質(zhì)膜H+-ATPase活性的調(diào)節(jié)是否也與質(zhì)膜環(huán)境有關(guān)?明晰這些問題，不僅對揭示質(zhì)膜H+-ATPase在植物對酸雨適應(yīng)性機(jī)制中的作用至關(guān)重要，也可為形成化控減災(zāi)的有效途徑提供理論依據(jù).鑒于此，本文選取重要糧食作物水稻作為研究對象，以相對生長速率、質(zhì)膜H+-ATPase水解活性與胞內(nèi)H+熒光強(qiáng)度、CAT活性、H2O2、MDA含量和質(zhì)膜脂肪酸組成為研究內(nèi)容，探討鑭對酸雨脅迫下水稻葉片質(zhì)膜H+-ATPase活性的影響機(jī)制，以期為豐富稀土增強(qiáng)植物耐酸性機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為尋求化控減災(zāi)的有效措施提供新的思考方向.
2 材料與方法
2.1 試材培養(yǎng)
供試水稻(Oryza sativa)品種為淮稻8號.挑選籽粒飽滿的種子用0.1%HgCl2消毒10 min，去離子水浸泡后于25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中催芽2 d，待幼苗長至2葉1心時移入6.88 L周轉(zhuǎn)箱中水培，營養(yǎng)液采用國際水稻研究所(IRRI)常規(guī)營養(yǎng)液配方，并略作修改.Fe以Fe-EDTA形式加入，保持營養(yǎng)液中Fe濃度為2.0 mg · L-1，并加入NaSiO3 · 9H2O保持營養(yǎng)液中SiO2濃度為120 mg · L-1，NH+4-N中加入5.89 mg · L-1雙氰胺作為硝化抑制劑.每次用H2SO4或NaOH將營養(yǎng)液pH調(diào)至5.5，營養(yǎng)液每隔3 d更換1次.培養(yǎng)光照強(qiáng)度為300 μmol · m-2 · s-1，光照12 h，晝/夜溫度為30 ℃/24 ℃，相對濕度為60%.待幼苗長至3葉1心時，選長勢相近的幼苗進(jìn)行處理.
2.2 試材處理
配制LaCl3溶液(15 mg · L-1).配制pH=1.0的模擬酸雨母液(SO42-/NO3-，3 ∶ 1，V/V)，用母液配制成pH=3.5、2.5的模擬酸雨溶液.用噴霧器先將LaCl3溶液均勻噴施于葉片，滴液為限，待葉面干涸后，將酸雨用同樣的方法噴施于葉片，對照(CK)噴施等量蒸餾水，連續(xù)處理5 d.處理結(jié)束后，取每株從上到下數(shù)第二葉位的葉片進(jìn)行指標(biāo)測定.實(shí)驗(yàn)處理設(shè)置：CK、pH=3.5 AR、pH=2.5 AR、La(15 mg · L-1)、La+pH 3.5 AR、La+pH 2.5 AR處理組.
2.3 指標(biāo)測定方法
相對生長速率測定參考文獻(xiàn)方法;質(zhì)膜H+-ATPase活性參照文獻(xiàn)方法;用酶解法提取水稻葉片原生質(zhì)體，用BCECF-AM熒光探針染料標(biāo)記細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀測定胞內(nèi)H+熒光強(qiáng)度來表示胞內(nèi)H+濃度;采用高錳酸鉀滴定法測CAT活性和采用硫酸鈦法測H2O2含量;采用硫代巴比妥酸法測MDA含量;采用氣相色譜測定質(zhì)膜脂肪酸組成.
2.4 數(shù)據(jù)處理與分析
所有數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SD)，所有原始數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差和差異顯著性用 SPSS16.0軟件分析.數(shù)據(jù)制圖在Origin8.0軟件中完成.
3 結(jié)果與分析
3.1 鑭對酸雨脅迫下水稻相對生長速率的影響
植物相對生長速率常用來表征植物的抗逆能力，即脅迫下植物生長的快慢.由圖 1可知：單一AR組水稻相對生長速率較CK分別降低24.7%(pH=3.5)和45.89%(pH=2.5);單一La組水稻相對生長速率較CK升高19.86%.La+pH 3.5組水稻相對生長速率與CK無顯著差異，較單一pH=3.5組升高18.03%，表明La緩解了pH=3.5 AR對水稻造成的傷害，這與周青的研究結(jié)果一致.La+pH 2.5組水稻相對生長速率較CK降低42.47%，與單一pH=2.5 AR組無顯著差異，表明La對pH=2.5 AR組造成的傷害未能起到緩解作用，推測可能是pH=2.5 AR嚴(yán)重破壞了水稻葉片光合系統(tǒng)，而此傷害已經(jīng)超出了La對光合系統(tǒng)的調(diào)控范圍，從而使水稻生長受到抑制.
圖1 鑭對酸雨脅迫下水稻相對生長速率的影響(圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，不同字母表示各處理間差異顯著(p<0.05)，下同)
3.2 鑭對酸雨脅迫下水稻葉片質(zhì)膜H+-ATPase活性和胞內(nèi)H+熒光強(qiáng)度的影響
質(zhì)膜H+-ATPase 能利用 ATP 水解釋放的能量調(diào)控細(xì)胞內(nèi)H+的平衡，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定.由圖 2a可知，單一AR組水稻葉片質(zhì)膜H+-ATPase活性較CK分別升高8.22%(pH=3.5)和降低27.40%(pH=2.5).單一La組質(zhì)膜H+-ATPase活性較CK升高13.01%.La+pH 3.5 AR組水稻葉片質(zhì)膜H+-ATPase活性較CK與單一pH=3.5 AR組分別升高26.03%和16.46%，推測可能是La作為一種效應(yīng)物與質(zhì)子泵C末端結(jié)合，解除其自抑制功能，從而增強(qiáng)了質(zhì)膜H+-ATPase活力表達(dá).La+pH 2.5 AR組水稻葉片質(zhì)膜H+-ATPase活性較CK降低19.86%，與單一pH=2.5 AR組無顯著差異.質(zhì)膜H+-ATPase活性受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，pH=2.5 AR下調(diào)了質(zhì)膜H+-ATPase的轉(zhuǎn)錄水平，盡管La對質(zhì)膜H+-ATPase的轉(zhuǎn)錄水平有上調(diào)作用，但最終La+pH 2.5 AR組H+-ATPase活性降低，表明La對AR脅迫下質(zhì)膜H+-ATPase活性的調(diào)節(jié)受AR強(qiáng)度的制約.
圖2 鑭對酸雨脅迫下水稻葉片質(zhì)膜H+-ATPase活性(a)和胞內(nèi)H+熒光強(qiáng)度(b)的影響
胞內(nèi)H+熒光強(qiáng)度增強(qiáng)表明胞內(nèi)H+增多.由圖 2b可知，單一AR組水稻葉片胞內(nèi)H+熒光強(qiáng)度較CK分別升高34.12%(pH=3.5)、69.88%(pH=2.5).單一La組胞內(nèi)H+熒光強(qiáng)度較CK降低12.04%.La+pH 3.5 AR組水稻葉片胞內(nèi)H+熒光強(qiáng)度較CK和單一pH=3.5 AR組分別降低21.69%和41.96%，結(jié)合質(zhì)膜H+-ATPase活性變化可知，可能是由于質(zhì)膜H+-ATPase活性升高，胞內(nèi)過多的H+被泵至胞外，維持了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使水稻恢復(fù)生長.La+pH 2.5 AR組水稻葉片胞內(nèi)H+較CK升高38.52%，而與單一pH=2.5 AR組無顯著差異，分析可能是由于質(zhì)膜H+-ATPase活性受抑制，大量H+在胞內(nèi)積累，使水稻的生長受到抑制.表明La調(diào)節(jié)植物耐酸性與調(diào)控質(zhì)膜H+-ATPase活性有關(guān)，調(diào)控效果受AR強(qiáng)度限制.
3.3 鑭對酸雨脅迫下水稻葉片膜脂過氧化與質(zhì)膜脂肪酸組成的影響
CAT是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可以分解植物體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的H2O2.MDA是細(xì)胞膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，其含量升高表示細(xì)胞膜脂過氧化程度加重.由表 1可知：單一pH=3.5 AR組CAT活性、H2O2和MDA含量和較CK分別升高7.99%、12.24%和34.25%.單一pH=2.5 AR組CAT活性較CK降低40.57%，H2O2和MDA含量較CK升高44.90%和70.92%.單一La組水稻葉片CAT活性較CK升高26.43%，H2O2和MDA含量較CK分別降低32.65%和28.30%.La+ pH 3.5 AR組水稻葉片CAT活性較CK升高32.38%，H2O2和MDA含量較CK無顯著變化，且與單一pH=3.5 AR組相比，CAT活性升高22.58%，H2O2和MDA含量分別降低19.57%和28.99%，推測可能是由于La改變了CAT的空間折疊態(tài)和卟啉活性中心的易變性，使CAT活性增強(qiáng)并清除體內(nèi)過多的H2O2，降低了膜脂過氧化程度.La+ pH 2.5 AR組水稻葉片CAT活性較CK降低37.91%，H2O2和MDA含量較CK升高38.78%和61.51%，但與單一pH=2.5 AR組相比，3個指標(biāo)均無顯著變化.嚴(yán)重玲等研究顯示，酸雨強(qiáng)度越大，作物對稀土的吸收和利用越少.本研究結(jié)果顯示：在pH=2.5 AR脅迫下，水稻葉片對La的吸收和利用量減少，La未能提高CAT活性，過多的H2O2造成了膜脂過氧化，產(chǎn)生過量的MDA，而MDA可能抑制膜上蛋白的合成，進(jìn)而導(dǎo)致質(zhì)膜H+-ATPase活性的降低.pH=3.5 AR脅迫下，La能促進(jìn)CAT活性升高，清除過多的H2O2積累，減輕質(zhì)膜過氧化.pH=2.5 AR引起的H2O2積累不僅抑制了CAT活性，也超出了La的清除能力.
表1 鑭對酸雨脅迫水稻葉片中CAT活性、H2O2和MDA含量的影響
脂肪酸不飽和度指數(shù)可用來表征脂肪酸的不飽和程度，IUFA升高表示脂肪酸不飽和程度增加.由表 2可知，單一AR組水稻葉片質(zhì)膜IUFA較CK分別降低5.32%(pH=3.5)和9.03%(pH=2.5);單一La組水稻葉片質(zhì)膜IUFA較CK升高3.77%.La+pH 3.5 AR組水稻葉片質(zhì)膜IUFA較CK無顯著差異，但較單一pH=3.5 AR組升高3.32%，結(jié)合MDA含量變化可知，La減輕了pH=3.5 AR誘發(fā)的膜脂過氧化，質(zhì)膜流動性增強(qiáng)，使質(zhì)膜的功能增強(qiáng)，質(zhì)膜H+-ATPase活性增強(qiáng).La+pH 2.5 AR組較CK降低10.08%，與單一pH=2.5 AR組無顯著差異，推測可能是La未能減輕pH=2.5 AR誘發(fā)的膜脂過氧化，膜通透性增大，導(dǎo)致質(zhì)膜的功能降低甚至喪失，質(zhì)膜H+-ATPase活性降低.表明La減輕pH=3.5 AR誘發(fā)的質(zhì)膜過氧化，進(jìn)而維持質(zhì)膜的流動性，使質(zhì)膜H+-ATPase保持較高活性;La未能減輕pH=2.5 AR誘發(fā)的質(zhì)膜過氧化，質(zhì)膜的流動性降低，質(zhì)膜H+-ATPase活性受抑未能緩解.
表2 鑭對酸雨脅迫下水稻葉片質(zhì)膜脂肪酸組成的影響
4 結(jié)論
1)La能緩解pH=3.5 AR對水稻生長的傷害，對pH=2.5 AR的防護(hù)效果不明顯，顯示La對AR脅迫下水稻生長的調(diào)節(jié)作用受AR強(qiáng)度限制.
2)La促進(jìn)pH=3.5 AR脅迫下質(zhì)膜H+-ATPase活性升高，減少胞內(nèi)H+，緩解AR傷害;而在pH=2.5 AR脅迫下，La對質(zhì)膜H+-ATPase調(diào)控效果不明顯，大量H+在胞內(nèi)積累，表明La調(diào)節(jié)植物耐酸性與調(diào)控質(zhì)膜H+-ATPase活性有關(guān)，調(diào)控效果受AR強(qiáng)度限制.具體參見污水寶商城資料或http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
3)La能通過促進(jìn)CAT活性來減輕pH=3.5 AR誘發(fā)的質(zhì)膜過氧化，進(jìn)而維持了質(zhì)膜的流動性，有助于質(zhì)膜H+-ATPase保持較高活性;pH=2.5 AR造成的活性氧積累超出了La的調(diào)控與清除能力，膜脂過氧化發(fā)生，質(zhì)膜的流動性降低，致使質(zhì)膜H+-ATPase活性受抑.研究發(fā)現(xiàn)，La能改善AR脅迫對質(zhì)膜環(huán)境的影響，進(jìn)而調(diào)節(jié)質(zhì)膜H+-ATPase活性.
