復合型生物絮凝劑產(chǎn)生菌篩選及絮凝機理研究

研制高效、無毒的絮凝劑是目前環(huán)境工程領域中的重要內(nèi)容,當今絮凝過程的研究趨勢已由過去側(cè)重工藝的優(yōu)化逐漸發(fā)展為現(xiàn)在側(cè)重藥劑的開發(fā).生物絮凝劑是一類由微生物產(chǎn)生的可使液體中不易降解的固體懸浮顆粒、菌體細胞及膠體粒子等凝聚、沉淀的特殊高分子代謝產(chǎn)物.該類絮凝劑是利用生物技術(shù),通過微生物發(fā)酵、分離提取而得到的具有生物降解性和安全性的新型、高效、廉價、無毒、無二次污染的水處理劑,可廣泛應用于給水和廢水處理領域.

生物絮凝劑是典型的環(huán)境友好型功能材料.生物絮凝劑的研究始于20世紀50年代,日本學者首先發(fā)現(xiàn)微生物培養(yǎng)液具有絮凝作用.1976年,Ｊ.Ｎａｋａｍｕｒａ等人對能產(chǎn)生絮凝效果的微生物進行了專門研究,掀起了微生物絮凝劑的研究熱潮.目前,該項研究工作集中在:(1)針對單一菌株的分離、鑒定和培養(yǎng)；(2)側(cè)重單一菌株所產(chǎn)絮凝劑的成分確定、凈化機理及其應用研究.生物絮凝劑的研究還僅限于實驗室水平,降低微生物絮凝劑生產(chǎn)成本是大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵.

復合型生物絮凝劑的概念是哈爾濱工業(yè)大學馬放教授率先提出的,是以稻草、秸稈等廉價生物質(zhì)材料為底物,利用纖維素降解菌群和絮凝菌群組成的復合型微生物絮凝劑產(chǎn)生菌菌群,進行兩段式發(fā)酵后分離提取而獲得的.本文針對復合型微生物絮凝劑產(chǎn)生菌高效菌株的篩選和最佳菌群的構(gòu)建進行了研究,并對絮凝機理進行了探討.

1　材料與方法

1.1　復合型生物絮凝劑的制備

1.1.1　菌種來源

絮凝菌來源于某煉油廠含油廢水處理單元曝氣池活性污泥.纖維素降解菌來自本實驗室.

1.1.2　培養(yǎng)基

絮凝菌分離培養(yǎng)基(ｇ/Ｌ):牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基[5].篩選培養(yǎng)基:葡萄糖,10.0ｇ；Ｋ2ＨＰＯ4,5.0ｇ；ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ,0.2ｇ；ＫＨ2ＰＯ4,2.0ｇ；ＮａＣｌ,0.1ｇ；尿素,0.5ｇ；酵母膏,0.5ｇ；ｐＨ,7.2～7.5.種子培養(yǎng)基:同篩選培養(yǎng)基.(注:葡萄糖在0.05ＭＰａ壓力下滅菌30ｍｉｎ,其他成分在0.1ＭＰａ壓力下滅菌20ｍｉｎ).纖維素降解菌種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基為濃縮3倍的赫奇遜培養(yǎng)基[5].

1.1.3　培養(yǎng)條件

1.1.3.1　種子培養(yǎng)

于新鮮斜面上取一環(huán)菌,接至裝有100ｍＬ種子培養(yǎng)基的250ｍＬ三角瓶中,在30℃、150ｒ/ｍｉｎ搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)24ｈ.

1.1.3.2　搖瓶培養(yǎng)

在500ｍＬ的三角瓶中裝入250ｍＬ篩選培養(yǎng)基,滅菌后,按10%的接種量將菌種自種子培養(yǎng)基中接入培養(yǎng)基中,在30℃、150ｒ/ｍｉｎ搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)72ｈ,以發(fā)酵液的絮凝效果作為絮凝菌株篩選標準.在500ｍＬ的三角瓶中裝入250ｍＬ發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌后,接入10%的纖維素降解菌群種子發(fā)酵液.在30℃、150ｒ/ｍｉｎ搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)120ｈ,此時接入10%的絮凝菌種子發(fā)酵液,相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1ｄ.根據(jù)最終發(fā)酵液的絮凝效果確定高效產(chǎn)絮菌株.將復篩得到的高效絮凝菌進行雙菌(1∶1)混合培養(yǎng)的正交試驗,采用上述相同的方法進行培養(yǎng).根據(jù)最終發(fā)酵液的絮凝效果構(gòu)建最佳的絮凝菌群.

1.2　測定方法

1.2.1　絮凝效果測定

初篩:在50ｍＬ量筒內(nèi)加入0.2ｇ高嶺土,1ｍＬ1%的ＣａＣｌ2水溶液,1ｍＬ發(fā)酵液,然后加水至50ｍＬ,搖勻,靜止沉淀15ｍｉｎ,同時以不加菌的培養(yǎng)基的高嶺土懸濁液為對照,目測找出絮凝效果較好的菌株.復篩:采用混凝杯罐試驗來測定絮凝劑的絮凝效果.此法同樣適于絮凝菌群絮凝效果的測定.具體過程為:在燒杯中加入5ｇ/Ｌ高嶺土懸濁液1000ｍＬ,加入10ｍＬ的發(fā)酵液和1 5ｍＬ的10%的ＣａＣｌ2水溶液作為助凝劑,同時以未接絮凝菌的培養(yǎng)基10ｍＬ和1 5ｍＬ的10%的ＣａＣｌ2水溶液作為空白對照.采用六聯(lián)的混凝攪拌儀攪拌完成之后,靜止20ｍｉｎ,然后使用濁度儀測定上清液的濁度,發(fā)酵液的絮凝效果用絮凝率進行表征,計算公式為μ/%=(Ａ-Ｂ)/Ａ×100,其中Ａ表示參照上清液的濁度,Ｂ表示加入發(fā)酵液絮凝之后上清液的濁度.

1.2.2　菌種鑒定

菌株鑒定的生理生化試驗參見文獻進行.

1 2 3　絮凝活性分布實驗

取10ｍＬ發(fā)酵液,3000ｒ/ｍｉｎ離心15ｍｉｎ,留上清液備用.沉淀物以蒸餾水洗滌2次后,加入10ｍｌ蒸餾水制成懸濁液.分別測定發(fā)酵原液、上清液以及沉淀物懸濁液的絮凝活性.

1.2.4　滅菌失活后絮凝活性測定實驗

將發(fā)酵液在121℃滅菌20ｍｉｎ,測定其絮凝活性.

1.2.5　復合型微生物絮凝劑有效成分分析

還原糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸(ＤＮＳ)比色法[8],蛋白質(zhì)含量測定采用Ｆｏｌｉｎ-酚測定法.

2　結(jié)果與討論

2.1　絮凝菌株篩選與鑒定

2.1.1　篩選結(jié)果

從處理含油廢水的活性污泥中共分離出132株菌,初篩得到25株具有絮凝作用的菌株；復篩采用這25株菌的發(fā)酵液做混凝杯罐試驗,發(fā)現(xiàn)其中12株為具有明顯絮凝效果的菌株,絮凝率均在65%以上,Ｆ2、Ｆ3、Ｆ5和Ｆ6菌株的絮凝率>80%.

2.1.2　菌種鑒定結(jié)果

對所得12株絮凝菌進行生理生化特性鑒定.根據(jù)菌株的菌落形態(tài)和生理生化特性可知,12株菌中,芽孢桿菌屬(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)8株,微球菌屬(Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ)2株,葡萄球菌屬(Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ)1株,微桿菌屬(Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ)1株,其中4株高效絮凝菌Ｆ2、Ｆ3、Ｆ5和Ｆ6均屬芽孢桿菌屬.

2.2　絮凝菌混合培養(yǎng)

將4株高效絮凝菌株Ｆ2、Ｆ3、Ｆ5和Ｆ6按照(1∶1)接種進行混合培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)Ｆ2和Ｆ6菌株組合所得發(fā)酵液絮凝效果優(yōu)于其他各組(表1),同時也優(yōu)于各個單菌,這一現(xiàn)象與文獻報道相符.ＫｕｒａｎｅＲ和Ｍａｔｓｕｙａｍａ研究結(jié)果表明,混合培養(yǎng)的條件下,不同微生物之間的相互作用促進微生物絮凝劑的產(chǎn)生.因此,該研究思路正確可行.后續(xù)試驗中均采用Ｆ2和Ｆ6作為復合型生物絮凝劑產(chǎn)生菌,用于生產(chǎn)復合型生物絮凝劑ＨＩＴＭ02.

現(xiàn)有研究認為,單株微生物的發(fā)酵存在目標產(chǎn)物轉(zhuǎn)化效率低,培養(yǎng)條件要求嚴格和對環(huán)境因素適應性差等缺陷,混菌發(fā)酵正逐漸引起人們的重視,有望解決單菌發(fā)酵存在的問題.復合型生物絮凝劑采用秸稈等富含纖維素的農(nóng)業(yè)廢棄物作為主要的碳源.國內(nèi)外的研究成果表明,雖然纖維素降解菌及其酶類在發(fā)酵工業(yè)中的應用已研究多年,仍然沒有實現(xiàn)單一菌種用于大規(guī)模降解纖維素.這是因為:(1)纖維素酶的合成受到降解物的阻遏,如葡萄糖,纖維二糖、蔗糖和淀粉等皆能抑制此酶的合成；(2)纖維素酶的催化能力受其酶促反應的反饋抑制；(3)纖維素酶在酶促反應液中不穩(wěn)定,易失活.復合型生物絮凝劑采用纖維素降解菌群和絮凝菌群兩段式發(fā)酵,發(fā)酵體系中纖維素的降解產(chǎn)物很快被絮凝菌利用,消除了纖維素酶的合成中可能受到的降解物的阻遏作用,使酶可以不斷生成,同時也解除了酶促反應終產(chǎn)物對酶的反饋抑制,使酶最大限度地對底物進行降解,實現(xiàn)高糖化率,產(chǎn)生的糖為“共存菌”,即絮凝菌,提供了生長發(fā)育所必需的碳源,實現(xiàn)了二者的互生和共生,實現(xiàn)了纖維素降解和微生物產(chǎn)絮兩個過程的有機組合.

2.3　絮凝活性實驗

2.3.1　絮凝活性分布

發(fā)酵液、離心后上清液以及沉淀物懸濁液的絮凝活性測定結(jié)果表明(圖1),上清液的絮凝活性遠高于沉淀物,說明絮凝有效成分主要存在于發(fā)酵液中,是微生物細胞的代謝產(chǎn)物.同時菌體細胞和纖維素等底物的代謝殘余物質(zhì)有一定的促進絮凝的作用.

2.3.2　滅菌失活后絮凝活性測定實驗

將發(fā)酵液在121℃滅菌20ｍｉｎ,測定其絮凝率為94.3%,與未經(jīng)過滅菌處理的發(fā)酵液相比,絮凝率僅下降了2.3%,說明復合型微生物絮凝劑具有良好的熱穩(wěn)定性.這一結(jié)果也進一步說明該絮凝劑中絮凝作用不是由菌體細胞產(chǎn)生的.相關(guān)文獻表明,高溫會嚴重影響某些生物絮凝劑的效率.因為高溫可使生物高分子變性,空間結(jié)構(gòu)改變,某些活性基團不再與懸浮顆粒結(jié)合,因而表現(xiàn)出絮凝活性的下降.例如Ｒ.ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ產(chǎn)生的絮凝劑在100℃的水中加熱15ｍｉｎ后,其絮凝活性下降50%.而復合型生物絮凝劑在加熱到121℃后,絮凝效果依然保持.這一性質(zhì)將有利于有效成份的提取、純化,為復合型微生物絮凝劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的安全性提供了保障.

2.4　復合型微生物絮凝劑有效成分分析及絮凝機理探討

發(fā)酵液有效成分測定結(jié)果如下:還原糖未檢出,總糖含量為1.76%,蛋白質(zhì)的含量為5.4%.發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的含量最高,并且在絮凝效果不好的批次實驗中,絮凝劑中蛋白質(zhì)的含量明顯降低(1.95%),同時總糖含量變化不大.因此,推斷在絮凝過程中起主要作用的可能是蛋白質(zhì)和多肽,多糖類物質(zhì)對絮凝只起輔助作用.根據(jù)上述實驗結(jié)果,分析復合型微生物絮凝劑的絮凝機理主要包括以下兩方面:

1)電中和作用:蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì),既可與酸又可與堿相互作用.絮凝劑與處理水樣中的顆粒進行廣泛的接觸,與顆粒表面帶的相反電荷發(fā)生中和作用,顆粒之間能夠充分地相互靠攏,使得吸引力成為主要作用力,排斥作用減弱,從而形成密實的絮體,促進顆粒的絮凝沉降.

2)吸附架橋作用:發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)、多肽和多糖等物質(zhì)均為半剛性長鏈大分子,投加到水中充分伸展,具有較大空間體積,對水中懸浮粒子具有吸附架橋作用.由掃描電鏡照片(圖2)可以清晰地觀察到,絮凝菌在發(fā)酵過程中分泌大量的黏液性物質(zhì),對水中懸浮顆粒具有一定的吸附作用.

同時,秸稈等富含纖維素的生物底物在發(fā)酵過程中降解不完全,其代謝殘留物可吸附有機大分子,即本身也具有良好的絮凝作用,作為復合型生物絮凝劑的一部分,起到良好的“增絮”作用.絮凝體的形成是一個復雜的過程,復合型微生物絮凝劑的廣譜活性和耐高溫性說明它是由多種機理共同起作用.為了更進一步解釋絮凝機理,還需作更深入的研究.通過以上研究可以看出,復合型微生物絮凝劑的特點是:其一,菌劑是復合型的,其發(fā)酵是利用纖維素降解菌群和絮凝菌群進行連續(xù)發(fā)酵,而非單一菌種發(fā)酵；其二,有效成分具有復合性,主要為蛋白質(zhì)、多肽、多糖類物質(zhì)以及底物的代謝殘留物.復合型微生物絮凝劑的生產(chǎn)通過混菌發(fā)酵,利用了秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物作為發(fā)酵底物,大大降低了生產(chǎn)成本,為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎.

3　結(jié)　論

1)從活性污泥中篩選得到4株絮凝率>80%的高效絮凝菌Ｆ2、Ｆ3、Ｆ5和Ｆ6,經(jīng)鑒定均屬芽孢桿菌屬.

2)4株高效絮凝菌中,Ｆ2和Ｆ6菌株按照1:1比例混合培養(yǎng)所得發(fā)酵液絮凝率可達93 1%,優(yōu)于各個單菌,同時優(yōu)于其他雙菌組合.

3)復合型生物絮凝劑ＨＩＴＭ02有效成分存在于發(fā)酵液中,具有良好的熱穩(wěn)定性.主要的有效成分包括蛋白質(zhì)、多糖和多肽類物質(zhì),與發(fā)酵過程中纖維素等的代謝殘留物共同作用,具有優(yōu)良的絮凝能力.

4)復合型生物絮凝劑ＨＩＴＭ02的絮凝機理包括蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)的電中和作用；蛋白質(zhì)、多肽、多糖等高分子物質(zhì)和纖維素等的代謝殘留物共同具有的吸附架橋作用.來源：21世紀精細化工網(wǎng)