隨著全球變暖問題越來越受到人們的關(guān)注，減臭氧發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而破壞臭氧層。N2O的產(chǎn)生來源于自然過程和人為排放。自然排放源占57%，主要包括海洋和土壤微生物的活動；人為排放源占43%，主要包括農(nóng)田氮肥施用、化石燃料燃燒、廢棄物和廢水生物轉(zhuǎn)化、生物質(zhì)燃燒等。
生物脫氮是污水處理廠常見的脫氮工藝，N2O會在生物脫氮過程中產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)在硝化階段和反硝化階段都會產(chǎn)生N2O，硝化過程中N2O來自羥胺（NH2OH）少溫室氣體的排放和增加溫室氣體的吸收正成為研究熱點(diǎn)。氧化亞氮（N2O）是《聯(lián)合國氣候變化框架公約》京都議定書中規(guī)定控制的6種溫室氣體之一，其溫室效應(yīng)作用力是二氧化碳（CO2）的298倍，N2O擴(kuò)散進(jìn)入平流層會與的不完全氧化，而反硝化過程中N2O作為反硝化的中間產(chǎn)物被釋放出來。雖然反硝化過程會造成N2O的釋放，但是完全反硝化過程可以將N2O還原為氮?dú)猓?/span>N2），所以其也被認(rèn)為是目前為止污水處理過程N2O唯一的匯。
生物脫氮過程離不開微生物的參與，能夠進(jìn)行硝化反應(yīng)的微生物包括氨氧化細(xì)菌（ammonia-oxidizingbacterium，AOB）、氨氧化古菌（ammonia-oxidizingarchaea，AOA）、亞硝酸鹽氧化菌（nitrite-oxidizingbacterium，NOB）以及厭氧氨氧化菌（Anammox）等，反硝化微生物主要包括好氧反硝化菌（aerobicdenitrifier）、自養(yǎng)反硝化菌（autotrophicdenitrifier）和反硝化聚磷菌（denitrifyingphosphate-removalbacterium，DPB）等。雖然反硝化被認(rèn)為是污水處理N2O唯一的匯，但并不是所有反硝化菌都能夠?qū)⑾跛猁}完全反硝化為N2.很多反硝化菌由于缺乏氧化亞氮還原酶（nitrousoxidereductase，NOS），其反硝化只能進(jìn)行到N2O這一步，這樣就造成了N2O的積累和釋放。典型缺乏NOS的反硝化細(xì)菌有紅球菌屬（Rhodococcus）、諾卡菌屬（Nocardioides）和放線菌屬（Actinomadura）等。如何提高具有NOS的反硝化菌活性和抑制缺乏反硝化還原酶系統(tǒng)的反硝化菌生長是緩解污水N2O釋放的重要措施。
目前關(guān)于污水處理過程中削減N2O的釋放策略主要圍繞兩個方面：一是通過調(diào)整運(yùn)行參數(shù)降低N2O的產(chǎn)生；二是通過提高完全反硝化進(jìn)程增加N2O的消耗。反硝化過程作為污水處理過程N2O的匯，具備更高的N2O減量化潛力，如何高效利用反硝化促進(jìn)N2O的減量是研究熱點(diǎn)。本文對污水生物處理過程中硝化和反硝化兩個過程N2O產(chǎn)生機(jī)理及影響因素進(jìn)行綜述分析，探討污水生物處理N2O減量策略，以期為緩解污水生物處理過程中N2O的釋放理論研究與技術(shù)開發(fā)提供借鑒。
1、污水處理過程中產(chǎn)生N2O微生物的特性
污水生物處理系統(tǒng)中能夠產(chǎn)生N2O的微生物種類有很多，不同類型的微生物產(chǎn)生N2O的方式會有所不同（表1）。
1.1 氨氧化細(xì)菌（AOB）
AOB是革蘭氏陰性菌，化能自養(yǎng)型菌，屬于變形菌門，可進(jìn)一步分成α、β、γ、Δ和ε變形細(xì)菌。AOB能夠產(chǎn)生氨單加氧酶（AMO）和羥胺氧化還原酶（HAO），可以利用AMO將銨根離子（NH4+）氧化為羥胺（NH2OH）后進(jìn)一步利用HAO將NH2OH氧化為亞硝酸根（NO2-），具體反應(yīng)如方程（1）（2）。AOB在硝化過程會因為NH2OH不完全氧化而產(chǎn)生N2O，AOB也能夠進(jìn)行反硝化作用，但是AOB不具備NOS編碼基因，也就意味著AOB只能將硝酸鹽還原為N2O而不能還原為N2，這會導(dǎo)致大量N2O的產(chǎn)生。
1.2 氨氧化古菌（AOA）
AOB并不是唯一能夠進(jìn)行氨氧化的微生物，AOA被證實具有氨氧化基因，也能夠進(jìn)行氨氧化。雖然AOA占比只有AOB的1/10到1/100，但是AOA適應(yīng)環(huán)境的能力更強(qiáng)且分布更廣泛，在低溫或低溶解氧的極端環(huán)境條件下依舊能夠發(fā)現(xiàn)AOA的存在。然而與AOB硝化作用不同，AOA并不含有HAO和細(xì)胞色素P460（cytP460），AOA氧化NH2OH的過程目前還不清楚。雖然現(xiàn)在還不明確AOA通過什么方式產(chǎn)生N2O，但是已經(jīng)檢測到其在硝化過程中產(chǎn)生了N2O。
1.3 厭氧氨氧化菌（Anammox）
厭氧氨氧化菌氨氧化作用不同于硝化作用的氨氧化，厭氧氨氧化菌利用亞硝酸鹽作為電子受體氧化NH4+，以碳酸氫鹽（HCO3-）或CO2作為碳源，最終產(chǎn)物為N2.由于厭氧氨氧化工藝是化能自養(yǎng)過程，不需要消耗外來有機(jī)碳源，所以被認(rèn)為是一種更經(jīng)濟(jì)有效的污水脫氮技術(shù)，并被廣泛用于處理高氨氮污水處理。雖然目前并無研究明確闡明厭氧氨氧化是如何產(chǎn)生N2O的，但是在厭氧氨氧化處理過程中檢測到大量N2O的產(chǎn)生。
1.4 完全氨氧化菌（Comammox）
在完全氨氧化菌未被發(fā)現(xiàn)之前，人們一直認(rèn)為微生物硝化過程是兩種菌的兩個過程，即NH4+首先被氨氧化菌氧化到NO2-，然后由NOB氧化NO2-到硝酸鹽（NO3-）。但是2015年發(fā)表在《Nature》的一篇論文報道了完全氨氧化菌的發(fā)現(xiàn)，該菌能夠獨(dú)立將NH4+氧化為NO3-。完全氨氧化菌也會在硝化過程中通過NH2OH不完全氧化產(chǎn)生N2O，但其產(chǎn)生N2O的量低于氨氧化菌產(chǎn)生的量，與AOA產(chǎn)生的量相當(dāng)。有文獻(xiàn)指出完全氨氧化菌之所以產(chǎn)生較少的N2O是因為其能夠獨(dú)自將NH4+氧化為NO3-，中間避免了NO2-的積累，從而減少了N2O的產(chǎn)生和釋放。
1.5 好氧反硝化菌
好氧反硝化菌在自然環(huán)境中分布廣泛，且種類繁多，包括副球菌屬（Paracoccus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、紅球菌屬以及鹵單胞菌屬（Halomonas）等。好氧反硝化菌屬于異養(yǎng)反硝化菌，需要有機(jī)碳源提供電子，能夠在好氧條件下在細(xì)胞周質(zhì)中進(jìn)行反硝化。好氧反硝化菌具有與缺氧反硝化菌同樣的反硝化系統(tǒng)，但因好氧反硝化菌不需要嚴(yán)格缺氧環(huán)境，而且大多數(shù)好氧反硝化菌都可以進(jìn)行硝化作用，這也就意味著好氧反硝化菌既能通過硝化過程的NH2OH不完全氧化產(chǎn)生N2O，也能通過反硝化產(chǎn)生N2O。
1.6 自養(yǎng)反硝化菌
自養(yǎng)反硝化細(xì)菌是化能自養(yǎng)型細(xì)菌，可以利用氫、硫化物或亞鐵離子（Fe2+）作為電子供體進(jìn)行反硝化，將硝酸鹽還原為N2.由于其可以利用無機(jī)碳源作為電子供體進(jìn)行反硝化，所以自養(yǎng)反硝化工藝被認(rèn)為可以用于低碳氮比（C/N）污水的脫氮處理。雖然自養(yǎng)反硝化過程可以實現(xiàn)低有機(jī)物、高氨氮負(fù)荷運(yùn)行，但是其過程同異養(yǎng)反硝化一樣依然會產(chǎn)生中間產(chǎn)物N2O。而且有研究發(fā)現(xiàn)，硫化物或Fe2+驅(qū)動的自養(yǎng)反硝化過程會增加N2O的釋放，主要原因是以硫化物為電子供體的自養(yǎng)反硝化的N2O還原速率相對較低。
1.7 反硝化聚磷菌（DPB）
DPB是一種可以兼顧反硝化脫氮和除磷的微生物，且其活性不受溶解氧的影響。DPB可以實現(xiàn)在一個細(xì)胞內(nèi)利用碳源同時進(jìn)行脫氮除磷，解決了傳統(tǒng)脫氮除磷之間的碳源競爭和污泥齡（SRT）之間的矛盾問題，進(jìn)而達(dá)到更經(jīng)濟(jì)更高效的脫氮除磷效率。雖然DPB在反硝化過程也會產(chǎn)生N2O，但是在足夠碳源存在以及低亞硝酸鹽濃度情況下，DPB能夠有效降低N2O的釋放。
2、N2O的形成機(jī)理
2.1 好氧硝化過程N2O形成機(jī)理
硝化細(xì)菌在好氧環(huán)境中可以利用HCO3-或CO2為碳源氧化NH4+生成NO2-和NO3-，在硝化過程中AOB和AOA將NH4+在AMO作用下氧化生成NH2OH，NH2OH在HAO作用下被氧化為NO2-，NOB利用亞硝酸氧化還原酶（NOR）將NO2-氧化為NO3-。在硝化過程中會造成NH2OH不完全氧化生成N2O，當(dāng)受到環(huán)境及生物本身因素的影響時NH2OH會氧化為硝酰基（NOH），進(jìn)而水解為N2O（圖1）。AOB和AOA都能通過產(chǎn)生膜內(nèi)酶AMO和膜外周質(zhì)酶HAO進(jìn)行氨氧化作用，其中編碼AMO功能基因是amoA、amoB和amoC，編碼HAO的功能基因是hao、cycA和cycB；NOB產(chǎn)生的NOR分為細(xì)胞周質(zhì)NOR和細(xì)胞質(zhì)膜NOR，編碼NOR的功能基因為norA和norB。
在硝化階段能夠產(chǎn)生N2O的原因是NH2OH的不完全氧化，而參與這個過程的酶是HAO，HAO屬于多血紅素蛋白酶，每個單體含有7個電子轉(zhuǎn)移血紅素和1個催化血紅素，存在于細(xì)胞膜外周質(zhì)中。HAO單體之間通過Tyr殘基和相鄰亞基的催化血紅素部分之間獨(dú)特的雙交聯(lián)共價連接，而根據(jù)交聯(lián)缺失情況可以分為氧化型HAOs和還原性HAOr，HAOr將NO2-還原為NO，也將NO和NH2OH還原為非生理底物。一直以來人們認(rèn)為HAO直接將NH2OH氧化為NO2-，然而有研究認(rèn)為HAO只能把NH2OH氧化為NO。鐵離子（Fe2+、Fe3+）會促進(jìn)HAO活性，且隨Na+和K+的增加而增加，但是Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+均會抑制HAO活性。
2.2 缺氧反硝化過程N2O形成機(jī)理
在缺氧環(huán)境中，反硝化細(xì)菌利用有機(jī)碳源提供的電子還原硝酸鹽最終生成N2，首先NO3-在硝酸鹽還原酶（NAR）作用下被還原為NO2-，NO2-在亞硝酸鹽還原酶（NIR）作用下還原為NO，NO在一氧化氮還原酶（Nor）作用下被還原為N2O，N2O在NOS作用下被還原為N2.反硝化過程既會產(chǎn)生N2O，也會消耗N2O，N2O產(chǎn)生與消耗的不平衡造成了N2O的積累（圖1）。完全反硝化過程是由4種反硝化酶來完成的，其中編碼NAR的基因是narGHJI；編碼NIR的功能基因有兩個，分別為nirK和nirS；編碼Nor的功能基因為norBC；編碼NOS的功能基因為nosZ。雖然大多數(shù)反硝化細(xì)菌具備完整的反硝化酶系統(tǒng)，但是電子分配的不均衡會致使N2O還原過程受阻，從而導(dǎo)致N2O的積累并釋放。有一些反硝化細(xì)菌如紅球菌屬、諾卡菌屬和放線菌屬的菌株缺乏編碼NOS基因，所以這些菌只能將NO3-還原到N2O這一步，這也就導(dǎo)致了N2O的釋放。雖然反硝化過程會產(chǎn)生N2O，但是反硝化過程是現(xiàn)在唯一已知能夠消耗N2O的過程。
在反硝化階段能夠影響N2O產(chǎn)生的酶有NAR、NIR、Nor、NOS這4種酶，其中Nor產(chǎn)生N2O，NOS還原N2O為N2，消耗N2O。細(xì)菌和真菌中含有的Nor是不同的，具有反硝化功能的真菌中的Nor屬于細(xì)胞色素P-450一族，而反硝化細(xì)菌中的Nor表現(xiàn)出與血紅素/銅細(xì)胞色素氧化酶相似的特征，且細(xì)菌中的Nor有兩個分支，分別為喹啉（qNor）和細(xì)胞色素C。Nor利用鐵作為其活性中心元素，將兩個NO還原為一個N2O。與Nor不同，并不是所有反硝化細(xì)菌都含有NOS，如紅球菌屬、諾卡菌屬和放線菌屬的多數(shù)菌株，這也是造成N2O積累釋放的原因之一。Zumft等人在1982首次提純了NOS，并鑒定其為多銅蛋白。NOS具有兩個Cu活性中心，分別為雙核CuA中心和硫化物橋接的四核銅中心（CuZ）組成的六銅原子雙中心酶。NOS作為反硝化過程的最后一個酶，也是降解N2O唯一已知的酶，其對于減少污水處理過程中N2O的釋放至關(guān)重要。
2.3 其他過程N2O的形成
除了硝化過程和反硝化過程會產(chǎn)生N2O外，在厭氧氨氧化系統(tǒng)中也檢測到了大量N2O氣體產(chǎn)生，但是現(xiàn)在并沒有直接的證據(jù)證明厭氧氨氧化過程會產(chǎn)生N2O（圖1），而且到目前為止還無法通過純培養(yǎng)技術(shù)獲得單一厭氧氨氧化菌，這也就意味著驗證厭氧氨氧化過程能否產(chǎn)生N2O以及如何產(chǎn)生N2O會更加困難。
3、N2O減量策略
N2O減量化策略主要是針對影響N2O產(chǎn)生和釋放因素進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，最終實現(xiàn)N2O減量（表2）。除了傳統(tǒng)的生化分析外，組學(xué)手段也被廣泛應(yīng)用于N2O減量策略的分析研究。
3.1 優(yōu)化工藝參數(shù)
不同污水處理工藝產(chǎn)生N2O的情況不同，有研究表明相較于A/O工藝和SBR工藝，氧化溝工藝產(chǎn)生的N2O更少。雖然利用SBR反應(yīng)器處理污水能夠高效去除COD并且能夠同時脫氮除磷，但是其好氧階段會產(chǎn)生大量N2O，有研究表明通過取消厭氧階段和延長閑置時間保障了生物營養(yǎng)物質(zhì)去除的同時減少了N2O的釋放。缺氧反硝化過程雖然能夠?qū)?/span>N2O還原為N2，但是也被觀察到N2O大量釋放的情況，而延長缺氧階段的水力停留時間被認(rèn)為能降低N2O的積累。
C/N會嚴(yán)重影響異養(yǎng)反硝化過程，低C/N會降低反硝化速率，原因在于異養(yǎng)反硝化過程需要碳源來提供電子，NOS無法獲得充足電子而失活，增加N2O的積累，所以提高C/N將有利于緩解N2O的釋放。進(jìn)水C/N也會影響好氧硝化過程N2O的釋放，進(jìn)水C/N越低N2O釋放量也會越高。有研究發(fā)現(xiàn)在短程硝化過程中，隨進(jìn)水氨負(fù)荷增加，N2O的釋放也會隨之增加。微生物代謝不同類型碳源的速率不同，產(chǎn)生電子能力不同，從而導(dǎo)致添加不同碳源下異養(yǎng)反硝化過程N2O的釋放量有所不同。研究表明乙酸作為碳源較乙醇會產(chǎn)生更多的N2O，甲醇作為碳源比其他長鏈碳化合物更適合減少N2O釋放。
溶解氧會影響N2O的產(chǎn)生，低溶解氧會導(dǎo)致好氧硝化過程NH2OH不完全氧化，造成N2O的產(chǎn)生，但也有研究表明短期低溶解氧會造成N2O增加，而經(jīng)長期低溶解氧馴化后，AOA/AOBamoA基因豐度增加，降低了N2O的產(chǎn)生。氧的存在會抑制NOS活性，從而造成N2O積累，所以在缺氧到好氧過渡階段會導(dǎo)致大量N2O釋放。可以通過控制溶解氧來調(diào)節(jié)反硝化細(xì)菌、AOB和NOB豐度，當(dāng)溶解氧為1.6mg/L時，增加了反硝化細(xì)菌和NOB豐度，緩解了N2O釋放。所以在污水處理工藝中控制溶解氧對于緩解N2O的釋放意義重大。
提高溫度對好氧硝化過程N2O的釋放有積極的作用，溫度升高會直接促進(jìn)N2O的釋放。溫度還會影響反硝化酶活性，溫度越低反硝化酶活性越低，溫度升高會提高反硝化速率，同時降低N2O的積累。
pH值也會影響硝化過程N2O的釋放，研究表明高pH值（7.5-7.6）下N2O釋放量低于低pH值（6.6-7.1）釋放量。pH值也會影響NOS活性，在pH值為6.5-8范圍內(nèi)，NOS活性隨pH值升高而增加，也就意味著高pH值有利于降低N2O的釋放。
污泥齡的長短是保持活性污泥活性的重要參數(shù)，污泥齡太短將導(dǎo)致世代時間長的微生物難以成為優(yōu)勢種屬。有研究表明，污泥齡越長將產(chǎn)生更少的N2O，因為污泥齡長的系統(tǒng)具有更高的NOS基因豐度，所以延長污泥齡將有助于增加含NOS基因的反硝化細(xì)菌比例。
3.2 調(diào)整微生物群落結(jié)構(gòu)
無論是硝化過程還是反硝化過程都是由微生物完成的，所以優(yōu)化微生物結(jié)構(gòu)也將有利于緩解N2O的產(chǎn)生和釋放，也就意味著增加具有完整反硝化酶系統(tǒng)的反硝化細(xì)菌豐度或減少缺乏NOS基因的反硝化細(xì)菌豐度也必定有利于緩解N2O的釋放。16SrRNA基因測序和宏基因組測序技術(shù)的應(yīng)用幫助了研究人員對微生物種類及微生物群落結(jié)構(gòu)變化的認(rèn)識，促進(jìn)了對污水處理過程中微生物產(chǎn)生N2O機(jī)理的研究。在很多關(guān)于N2O減量的研究中發(fā)現(xiàn)，有效的減量化措施都會導(dǎo)致具有完整反硝化酶系統(tǒng)的反硝化細(xì)菌豐度增加，而在N2O增加的措施中缺乏NOS基因的反硝化細(xì)菌會增加。也有研究發(fā)現(xiàn)添加具有N2O消除能力的細(xì)菌或者馴化富集具有能夠消除N2O的菌群能夠有效緩解N2O的積累。雖然現(xiàn)在關(guān)于通過優(yōu)化微生物群落結(jié)構(gòu)緩解N2O釋放的策略很少，但是所有緩解策略的結(jié)果都導(dǎo)致了微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。
3.3 提高完全反硝化酶活性
NOS是反硝化最后一步的酶，也是消耗N2O的酶，如果能夠提高NOS活性，促進(jìn)N2O的還原必然也會減少N2O的釋放。NOS含有兩個由6個銅原子組成的雙催化中心，通過添加銅離子（Cu2+）可以促進(jìn)NIR和NOS的活性，減少亞NO2-積累的同時促進(jìn)了N2O的消耗，實現(xiàn)N2O的減量排放。
生物炭被廣泛用于土壤中N2O的減量，也用于促進(jìn)污水反硝化細(xì)菌活性。在生物炭表面含有大量氧化還原基團(tuán)，這些活性基團(tuán)會促進(jìn)反硝化細(xì)菌外源碳代謝，調(diào)節(jié)電子分配，促進(jìn)反硝化還原酶活性，提高了N2O的消耗。石墨烯被認(rèn)為是一種具有革命性的材料，具有極強(qiáng)的電子傳遞能力，可以促進(jìn)反硝化過程中電子生成和傳遞，從而促進(jìn)含鐵酶的活性，減少N2O的釋放。
4、小結(jié)與展望
在污水生物處理過程中N2O產(chǎn)生于NH2OH不完全氧化和反硝化中間產(chǎn)物。現(xiàn)在普遍認(rèn)為反硝化過程是主要的N2O貢獻(xiàn)途徑之一，但是反硝化也是N2O唯一的匯，所以如何控制好反硝化過程將對緩解N2O至關(guān)重要�，F(xiàn)在的研究多通過對污水處理工藝參數(shù)的優(yōu)化來緩解N2O的釋放。酶學(xué)、宏基因組等手段也被不斷用于探索N2O形成機(jī)理及影響因素，以尋找更加合理的方法減少N2O的排放。
本文總結(jié)了污水生物處理過程中參與產(chǎn)生N2O的微生物、微生物氮轉(zhuǎn)化過程中N2O產(chǎn)生的機(jī)理、影響N2O生成的酶及現(xiàn)階段N2O減量化策略�，F(xiàn)階段對于污水生物處理過程中N2O生成機(jī)理和微生物群落結(jié)構(gòu)對N2O積累的影響仍然沒有清晰的認(rèn)識，還需要進(jìn)一步研究。
（1）污水中排放的N2O最原始來源始終是污水中的化合態(tài)氮（有機(jī)氮、氨氮、硝態(tài)氮），所以對氮元素管理尤為重要。但是大多N2O減量化策略都停留在實驗室階段，在實際工程應(yīng)用中并沒有得到廣泛應(yīng)用，究其原因是當(dāng)前對N2O排放管控不嚴(yán)格、實際應(yīng)用的污水處理工藝改造成本高、多數(shù)N2O減量化策略成本增加、可能會導(dǎo)致出水水質(zhì)變差等問題。
（2）如何直接調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)以減少N2O排放現(xiàn)在還是個挑戰(zhàn)，但是很多研究表明微生物群落結(jié)構(gòu)優(yōu)化有助于緩解N2O的釋放。能夠篩選出具有強(qiáng)N2O還原能力的微生物將有助于N2O的減量。
（3）完全反硝化過程是N2O的匯，如何促進(jìn)完全反硝化過程是N2O匯發(fā)揮作用最根本的問題，然而反硝化是個復(fù)雜的過程，如何富集含有完整反硝化系統(tǒng)微生物以及調(diào)節(jié)各個酶之間的相互作用是一件困難的事情，但是完全反硝化過程終究是消耗污水生物處理過程中N2O唯一的途徑，值得研究人員深入研究。（來源：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部成都沼氣科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)村可再生能源開發(fā)利用重點(diǎn)實驗室）
