1 引言
活性污泥是微生物與懸浮物質(zhì)、膠體物質(zhì)混凝交織在一起所形成的絮狀物質(zhì)，它的結(jié)構(gòu)和功能的中心是菌膠團(tuán).在菌膠團(tuán)上，生長(zhǎng)著細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和某些后生動(dòng)物，這些微生物能分泌具有粘著性的膠狀物質(zhì)，對(duì)微小顆粒和可溶性有機(jī)物有強(qiáng)烈的吸附能力，在水流的作用下與懸浮顆粒相碰撞、粘連，形成活性污泥絮體.通過重力作用進(jìn)行泥水分離是活性污泥處理系統(tǒng)中的重要環(huán)節(jié)，污泥的沉降性能決定了處理工藝的整體效率.已經(jīng)被研究的影響污泥沉降性能的主要因素包括：絲狀菌含量、絮體的粒徑分布、絮體的表面電荷和絮體的親疏水性等.目前普遍認(rèn)為，絲狀菌數(shù)量增多時(shí)，絮體變得松散.絮體的表面凈負(fù)電荷可以在絮體之間產(chǎn)生排斥勢(shì)能，使絮體難以進(jìn)一步接觸凝聚.絮體的親疏水性決定了其內(nèi)部的含水率，含水率越高污泥比重越小.胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substance，EPS)是微生物所分泌的覆蓋在細(xì)菌細(xì)胞壁外的高分子物質(zhì)，它的含量和組成對(duì)活性污泥的絮體結(jié)構(gòu)、表面電荷、親疏水性和沉降性能都有很大影響.此外，微生物群落結(jié)構(gòu)也是影響活性污泥處理系統(tǒng)正常運(yùn)行的重要因素.微生物種群豐富意味著其內(nèi)部貯存著可以在不同環(huán)境下生長(zhǎng)具有不同特性的微生物，因此，可以抵抗環(huán)境的劇烈變化.微生物種群豐富強(qiáng)化了其對(duì)特定功能的保持及對(duì)沖擊負(fù)荷的快速恢復(fù)能力，同時(shí)豐富了基質(zhì)的利用途徑.
在生物流化床處理工程泥水分離區(qū)中，基于不同流體運(yùn)動(dòng)速度，污泥相存在比重方面的差異，密實(shí)型絮團(tuán)沉在底部，顆粒大，而在反應(yīng)器的頂部，通常會(huì)出現(xiàn)少量污泥游離于上清液中難以沉降.因此，可以通過沉降作用或流體力場(chǎng)分離作用實(shí)現(xiàn)基于上述現(xiàn)象污泥的異質(zhì)性分離，由此，本文把通過異質(zhì)性分離得到的沉降速度快慢不同的污泥分別定義為聚結(jié)型污泥與離散型污泥，探究所分離的污泥在活性、胞外聚合物與微生物群落結(jié)構(gòu)方面是否存在內(nèi)部相關(guān)性.離散型污泥與聚結(jié)型污泥相比，其絮體顆粒更小，結(jié)構(gòu)更松散.目前還沒有發(fā)現(xiàn)針對(duì)生物流化床處理系統(tǒng)活性污泥的這種異質(zhì)性加以研究的文獻(xiàn)報(bào)道.為了初步考察聚結(jié)型污泥與離散型污泥的活性差異，本文采用連續(xù)穩(wěn)定運(yùn)行3年以上的焦化廢水處理工程好氧工藝的混合液作為研究對(duì)象，該生物處理單元采用流化床結(jié)構(gòu)，生物流化床通過置入軸向內(nèi)導(dǎo)流筒使氣液固三相在反應(yīng)器內(nèi)循環(huán)運(yùn)動(dòng).混合液在強(qiáng)大的氣流沖擊性下呈流化態(tài)，因此，污泥呈絮體狀.利用旋流離心的方法分離出離散型絮狀污泥，以聚結(jié)型絮狀污泥作為對(duì)照，在異質(zhì)性方面考察兩種污泥在EPS、微生物活性和微生物群落結(jié)構(gòu)方面的差異.其中，微生物活性用有機(jī)物平均降解速率和比耗氧速率來表征.上述研究工作的動(dòng)機(jī)是，若能夠證明在廢水生物處理工程中存在污泥的異質(zhì)性，而又可以通過工程手段應(yīng)用污泥的異質(zhì)性，則有可能調(diào)控生物處理系統(tǒng)使之處于污泥性質(zhì)分配功能化的過程，有選擇性地從反應(yīng)器中識(shí)別污泥齡長(zhǎng)的老化污泥，由此保持系統(tǒng)內(nèi)的高活性.
2 材料與方法
2.1 污泥的采集與分離
本研究采集的水樣與活性污泥樣品均來自寶鋼集團(tuán)廣東韶鋼焦化廠酚氰廢水處理站，該廢水處理站始建于2004年，由本團(tuán)隊(duì)提供技術(shù)并設(shè)計(jì)，生物處理水量為70~80 m3 · h-1，處理出水穩(wěn)定在《煉焦化學(xué)工業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB16171—2012)限值以內(nèi).本研究從二級(jí)好氧池采集泥水混合液20 L，將混合液倒入水桶中，使用木棒緩慢攪動(dòng)，利用離心作用分離污泥.從水桶邊緣采集到的污泥為比重更大的聚結(jié)型污泥，從水桶中央采集到的污泥為比重更輕的離散型污泥.采集污泥后立即測(cè)定污泥常規(guī)指標(biāo).
2.2 有機(jī)物降解實(shí)驗(yàn)
通過比較兩種污泥的有機(jī)物降解速率來考察微生物活性的差異，具體做法為：通過離心機(jī)將聚結(jié)型污泥與離散型污泥脫水，得到含水率基本一致的濕污泥.將焦化廢水原水稀釋1倍，調(diào)節(jié)pH至7.0~7.5，按C ∶ N ∶ P=100 ∶ 5 ∶ 1的比例添加KH2PO4，獲得實(shí)驗(yàn)廢水.搖瓶實(shí)驗(yàn)設(shè)置4組對(duì)照組，所添加的濕污泥分別為3.0、6.0、9.0、12.0 g.投加配制好的實(shí)驗(yàn)廢水250 mL，搖勻后立即從各搖瓶中取混合液100 mL測(cè)定MLSS和MLVSS. 隨后用薄膜和紗布封口，放入搖床中，溫度和轉(zhuǎn)速分別設(shè)為(30.0±1.0)℃和200 r · min-1.定時(shí)取樣檢測(cè)COD和TOC濃度，有機(jī)物平均降解速率按式(1)和(2)計(jì)算.
式中，[COD]0、[TOC]0和[COD]t、[TOC]t分別為某一時(shí)間段內(nèi)初始時(shí)和終止時(shí)的COD和TOC濃度(mg · L-1)，t為間隔時(shí)間(h)，[MLVSS]為揮發(fā)性懸浮固體濃度(mg · L-1).
2.3 測(cè)試方法 2.3.1 常規(guī)指標(biāo)
pH值、COD、MLSS、MLVSS均參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法(第4版)》測(cè)定，TOC采用島津TOC-VCPH測(cè)定. 2.3.2 胞外聚合物(EPS)取2.1節(jié)中分離得到的聚結(jié)型污泥與離散型污泥各50 mL，在4 ℃下以5000 r · min-1離心20 min，得到污泥上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，用于Soluble EPS的測(cè)定.棄去剩余上清液，以蒸餾水補(bǔ)足到原體積，充分混勻后加蓋密封，在80 ℃恒溫水浴鍋中加熱40 min后，在4 ℃下以5000 r · min-1轉(zhuǎn)速離心20 min，得到上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，用于Bound EPS的測(cè)定. EPS中的多糖與蛋白質(zhì)的測(cè)定分別采用硫酸苯酚法和考馬斯亮藍(lán)G-250染色法.
2.3.3 比耗氧速率
將2.1節(jié)中分離得到的聚結(jié)型污泥與離散型污泥悶曝2 h，取20 mL污泥于血清瓶中，添加20 mL已配制好的焦化廢水原水和80 mL已曝氣至飽和溶氧狀態(tài)的蒸餾水，置于恒溫磁力攪拌裝置中，用磁力攪拌器將污泥混勻，溫度控制在(25.0±1.0)℃.密封瓶口，在線記錄DO變化曲線.內(nèi)源呼吸對(duì)照組則不添加焦化廢水原水，直接添加100 mL已曝氣至飽和溶氧狀態(tài)的蒸餾水.測(cè)試結(jié)束后，測(cè)定污泥MLVSS并按式(3)計(jì)算比耗氧速率(SOUR).
式中，[DO]0、[DO]t分別為測(cè)定初始時(shí)和終止時(shí)的溶解氧濃度(mg · L-1)，t為測(cè)定時(shí)間(h)，[MLVSS]為揮發(fā)性懸浮固體濃度(mg · L-1).
2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)分析 2.4.1 基因組DNA的提取
將2.1節(jié)中分離得到的兩種污泥抽濾脫水獲得干污泥，各取100.0 mg干污泥，使用Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)，通過Buffer SCL裂解樣品，釋放基因組DNA，然后通過Buffer SP和氯仿去除蛋白質(zhì)的干擾. 抽提獲得的DNA樣品貯存于-20 ℃冰箱中，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增. DNA樣品用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè). 2.4.2 PCR擴(kuò)增 總細(xì)菌的PCR擴(kuò)增采用對(duì)大多數(shù)細(xì)菌和古細(xì)菌16S rDNA基因V3區(qū)都具有特異性的引物對(duì)F341-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCGG CGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAG GCAGCAG-3′)和R534(5′-ATTACCGCGGCTGCTG G-3′)，氨氧化菌的PCR擴(kuò)增采用對(duì)氨氧化菌具有特異性的引物對(duì)CTO189f(5′-CCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGG GAGAAAAGCAGGGGATCG-3′)和CTO654r(5′-CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC-3′.反應(yīng)采用50 μL體系：2 μL DNA模板，2 μL上游引物，2 μL下游引物，25 μL Taq PCR Master Mix，19 μL無核酸雙蒸水. PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè).
2.4.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)
采用Bio-rad公司Dcode突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離，凝膠濃度為8%，變性劑濃度為30%~60%，溫度60 ℃，在60 V的電壓下電泳12 h. 結(jié)束后，將凝膠進(jìn)行銀染，待條帶出現(xiàn)后拍照，在凝膠成像系統(tǒng)上成像檢測(cè)，獲得DGGE圖譜. 隨后用75%酒精消毒后的手術(shù)刀切下DGGE凝膠條帶，回收保存于200 μL薄壁管，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行克隆測(cè)序. 2.4.4 DGGE圖譜條帶分析 利用Quantity One軟件對(duì)DGGE圖譜中條帶的位置及強(qiáng)度進(jìn)行模擬分析，得到各條帶的波峰面積，利用Shannon指數(shù)(H)來評(píng)價(jià)污泥樣品的微生物豐富程度，計(jì)算公式為：
式中，ni為峰面積，N為所有峰的總面積.
利用戴斯系數(shù)(Cs)評(píng)價(jià)污泥樣品之間微生物種群的相似性，計(jì)算公式為：
式中，j為泳道A和B的共有條帶的數(shù)量，a和b分別是泳道A和B中的條帶數(shù).
將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行處理后提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，采用BLAST進(jìn)行目標(biāo)序列和基因庫中所含序列的相似性分析，得到同源性最近的序列.
3 結(jié)果與討論(Results and discussion) 3.1 污泥形態(tài)與特性比較
通過旋流分離裝置分離得到聚結(jié)型污泥與離散型污泥后立即進(jìn)行掃描觀察，結(jié)果如圖 1所示.由圖 1可知，兩種污泥均呈絮體狀，外型不規(guī)則.相比而言，聚結(jié)型污泥結(jié)構(gòu)更為密實(shí)，絮體之間連接緊密，而離散型污泥絮團(tuán)較小，結(jié)構(gòu)更為松散.兩種污泥常規(guī)指標(biāo)如表 1所示，離散型污泥與聚結(jié)型污泥SVI值分別為78.9與56.0 mL · g-1. SVI即污泥體積指數(shù)，是衡量活性污泥沉降性能的指標(biāo)，聚結(jié)型污泥SVI值低于離散型污泥表明其污泥沉降性能更好，污泥比重更大.
采用2.3.2節(jié)中所述方法測(cè)定兩種污泥的胞外聚合物，結(jié)果如圖 2所示.胞外聚合物是微生物細(xì)胞分泌的粘性物質(zhì)，主要成分為多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì).其中，Bound EPS主要是緊密結(jié)合在細(xì)胞外殼的束縛性聚合物及附著有機(jī)物，Soluble EPS主要是可溶解的大分子物質(zhì)、膠體和粘液. 數(shù)據(jù)顯示，離散型污泥單位質(zhì)量MLVSS中的Bound EPS和Soluble EPS更高，這一結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)果相符.EPS的含量與污泥的沉降性能呈負(fù)相關(guān).離散型污泥EPS含量更高，導(dǎo)致污泥表面電負(fù)性較大，絮體表面的凈負(fù)電荷可以在絮體之間產(chǎn)生排斥勢(shì)能，導(dǎo)致污泥結(jié)構(gòu)變得松散.
3.2 污泥有機(jī)物降解速率及耗氧速率比較
設(shè)置4組不同污泥濃度的對(duì)照組(表 2)，添加配制好的實(shí)驗(yàn)廢水，進(jìn)行有機(jī)物降解實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得到COD、TOC平均降解速率如表 3和表 4所示.
COD與TOC存在一定的相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中二者在數(shù)值和變化規(guī)律上基本吻合.結(jié)果表明，在最初的8 h中，降解速率較低，大部分有機(jī)物在8~20 h中得到降解.對(duì)照組1由于污泥濃度小，有機(jī)物負(fù)荷更高，因此，每克污泥有機(jī)質(zhì)所降解的有機(jī)物更多，其降解速率最大值出現(xiàn)在16~20 h. 對(duì)照組2、3、4降解速率最大值出現(xiàn)在8~16 h. 在這個(gè)時(shí)間段中對(duì)照組1中離散型污泥降解速率更高，而在對(duì)照組2、3和4中聚結(jié)型污泥降解速率更高.由于微生物活性差異較小，因此，在對(duì)照組1和2中兩種污泥的有機(jī)物平均降解速率沒有明顯規(guī)律，而在高污泥濃度的對(duì)照組3和4中，有機(jī)物平均降解速率呈現(xiàn)的規(guī)律較為明顯，離散型污泥的有機(jī)物平均降解速率要低于聚結(jié)型污泥.
微生物內(nèi)源呼吸是指在沒有其他基質(zhì)可以利用的情況下微生物通過消耗內(nèi)在儲(chǔ)存的物質(zhì)完成生命活動(dòng)，而外源呼吸是指在添加實(shí)驗(yàn)廢水后微生物利用外界供給的物質(zhì)進(jìn)行代謝活動(dòng)，此時(shí)內(nèi)源呼吸并不顯著. 實(shí)驗(yàn)所采集的污泥為好氧污泥，微生物在降解有機(jī)物和硝化過程中都要消耗氧氣.微生物的新陳代謝速率可以通過耗氧速率來反映.本文測(cè)定了兩種污泥在內(nèi)源呼吸時(shí)和外源呼吸時(shí)的比耗氧速率，結(jié)果如圖 3所示.聚結(jié)型污泥無論是內(nèi)源呼吸還是外源呼吸時(shí)的比耗氧速率都要高于離散型污泥，說明其微生物活性更高.
3.3 污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)分析
焦化廢水是由原煤的高溫干餾、煤氣凈化和化工產(chǎn)品精制過程中產(chǎn)生的一種成分極為復(fù)雜的廢水，除了氨、氰、硫氰根、氟化物等無機(jī)污染物外，還含有酚、油、胺、萘、吡啶、喹啉、蒽等雜環(huán)及多環(huán)芳香族化合物(PAHs). 在生物處理系統(tǒng)中多種微生物以廢水中有機(jī)物及無機(jī)成分為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在系統(tǒng)中大量繁殖，形成了較為穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng).DGGE圖譜中處于不同位置的條帶代表一個(gè)可能的細(xì)菌類群或可操作分類單位(Operational Taxonomic Unit，OTU)，條帶越多說明生物多樣性越豐富，條帶染色后的熒光強(qiáng)度則反應(yīng)該細(xì)菌的豐富度，條帶信號(hào)越亮，表示該種屬的數(shù)量越多，從而反映污泥中微生物的種類和數(shù)量.通過條帶的信號(hào)強(qiáng)度可以看出處于優(yōu)勢(shì)地位的微生物種群.
總細(xì)菌DGGE圖譜如圖 4a所示，對(duì)比兩種污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)可以看出，離散型污泥與聚結(jié)型污泥內(nèi)部微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異，二者的相似度以戴斯系數(shù)表示，為72.7%.在聚結(jié)型污泥DGGE泳道上觀察到40條不同的條帶，計(jì)算得到其Shannon指數(shù)為2.15. 在離散型污泥DGGE泳道上觀察到27條不同的條帶，其Shannon指數(shù)為1.55，表明聚結(jié)型污泥內(nèi)部微生物種群更為豐富，而離散型污泥上所附著的微生物種類更少，某些微生物種群在離散型污泥中豐度很低，如B and 1、2、3、4、5、21、27. 因此，離散型污泥中的微生物種類較少?zèng)Q定了其在抗干擾能力和基質(zhì)利用途徑方面與聚結(jié)型污泥存在差異. 兩種污泥內(nèi)部?jī)?yōu)勢(shì)種群也存在差異，離散型污泥中優(yōu)勢(shì)種群為B and 9、11、12、20、24、25，聚結(jié)型污泥優(yōu)勢(shì)種群為B and 7、10、11、17、20、23、25.圖譜中的條帶經(jīng)克隆測(cè)序后將序列信息提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，所有的條帶均在GenBank數(shù)據(jù)庫中找到了同源性很高的種群. 如表 5所示，大部分菌種為未鑒定或培養(yǎng)的菌種，分布于不同的綱及屬. B and 19、23、25、26、27、31、32屬于變形菌綱(Proteobacteria). B and 1經(jīng)比對(duì)鑒定其序列與硫桿菌屬(Thiobacillus sp.)細(xì)菌接近，同源性為100%，該菌可以將廢水中還原態(tài)硫化物氧化為硫酸鹽. 與B and 3同源性達(dá)99%的Diaphorobacter sp.是一種苯酚降解菌. 數(shù)據(jù)庫中與B and 4同源性最高的是Uncultured Bacteroidetes bacterium clone CG38，該菌種是在負(fù)載不同電極材料的微生物燃料電池當(dāng)中發(fā)現(xiàn)的. B and 21與Sphingopyxis sp.的同源性達(dá)到100%，該菌種是從石油污染土壤和石油廢水中篩選得到，經(jīng)研究鑒定為高效多環(huán)芳烴降解菌.上述的3株菌種已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和鑒定為對(duì)污染物的去除具有主要作用的菌群，因此，與焦化廢水中污染物的去除有直接的聯(lián)系，它們均出現(xiàn)在聚結(jié)型污泥的DGGE圖譜中，但在離散型污泥中豐度很低，這與兩種污泥在有機(jī)物降解速率上的差異有著密切的聯(lián)系.
韶鋼焦化廠酚氰廢水處理站一期工程一級(jí)好氧池中大部分易降解有機(jī)物和部分可降解的有毒物質(zhì)得到去除，同時(shí)，氰化物、硫氰化物被氧化為氨氮，二級(jí)好氧池主要是負(fù)責(zé)氨氮的硝化，因此，其內(nèi)部含有豐富的氨氧化菌.氨氧化菌的DGGE圖譜如圖 4b所示，聚結(jié)型污泥內(nèi)部氨氧化菌種群比離散型污泥更為豐富，兩者的Shannon指數(shù)分別為0.90和0.60. 將氨氧化細(xì)菌的主要條帶進(jìn)行克隆測(cè)序，經(jīng)條帶克隆測(cè)序鑒定得出二級(jí)好氧池污泥中氨氧化細(xì)菌主要為β-變形亞綱中的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)，如B and 1、3、4、6、8. B and 5為亞硝化螺旋菌屬(Nitrosospira). B and 2與Uncultured bacterium clone LR A2-14同源性達(dá)到97%，該克隆序列是在A2O焦化廢水處理工程好氧池的污泥中發(fā)現(xiàn)的.基因數(shù)據(jù)庫中與B and 3最為相似的序列是Uncultured Nitrosomonas sp. clone R1-1，該克隆序列是在脫氮生物反應(yīng)器的污泥中提取的，該反應(yīng)器以喹啉為目標(biāo)降解物. B and 3、4、6、7為二者所共有，B and 1、2、5、8所代表的微生物菌屬在離散型污泥中豐度很低.活性污泥中氨氧化菌種類越少，對(duì)復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)能力就越弱，其硝化作用的抗干擾能力也越弱.
4 結(jié)論
1)生物流化床處理系統(tǒng)污泥中存在著離散型污泥與聚結(jié)型污泥的異質(zhì)性，前者結(jié)構(gòu)松散、沉降性能較差，后者結(jié)構(gòu)密實(shí)，沉降性能較好.造成兩種污泥在性狀和沉降性能上的差異初步認(rèn)為是由其中EPS含量的高低所造成.聚結(jié)型污泥較離散型污泥有更強(qiáng)的基質(zhì)降解能力，更高的內(nèi)、外源呼吸比耗氧速率.由此推測(cè)出沉降性能好即比重大的聚結(jié)型污泥表現(xiàn)出比離散型污泥更高的活性.這種異質(zhì)性的存在對(duì)于提高生物反應(yīng)器的處理效率具有實(shí)質(zhì)性意義.具體參見污水寶商城資料或http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
2)生物流化床處理系統(tǒng)中污泥異質(zhì)性的存在還表現(xiàn)在內(nèi)部微生物群落結(jié)構(gòu)在種群豐度上的差異.無論是總細(xì)菌還是氨氧化菌，聚結(jié)型污泥的群落結(jié)構(gòu)比離散型污泥更為豐富.聚結(jié)型污泥總細(xì)菌DGGE圖譜中存在3株已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和鑒定為對(duì)污染物的去除具有主要作用的菌群，而它們?cè)陔x散型污泥中豐度很低;聚結(jié)型污泥中氨氧化細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種群為β-變形亞綱中的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和亞硝化螺旋菌屬(Nitrosospira)，而離散型污泥中亞硝化螺旋菌屬(Nitrosospira)豐度很低，未出現(xiàn)在DGGE圖譜中.
