1 引言(Introduction)
生物脫氮(Biological Nutrient Removal，BNR)是主流的和最具成本優(yōu)勢的脫氮技術(shù)，主要由自養(yǎng)硝化和異養(yǎng)反硝化兩階段組成.反硝化過程可以在缺氧和厭氧條件下進(jìn)行，亞硝酸鹽氮先被還原為硝酸鹽氮，硝酸鹽氮再被還原為氣態(tài)氮，最終實(shí)現(xiàn)氮的去除，但氧可以取代亞硝酸鹽和硝酸鹽作為電子受體使反硝化過程失效.因?yàn)閭鹘y(tǒng)脫氮理論認(rèn)為，氧作為電子受體是優(yōu)先于亞硝酸鹽和硝酸鹽的，后者不再是末端電子受體，進(jìn)而使反硝化過程被抑制.隨著生物脫氮理論研究的進(jìn)一步深入，20世紀(jì)80年代，Thiosphaera pantotropha作為第一種好氧反硝化菌在脫硫反硝化系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)，并證明存在好氧反硝化酶系統(tǒng).在這一研究成果的基礎(chǔ)上，新的好氧反硝化菌不斷被發(fā)現(xiàn)和分離出來.而好氧反硝化理論可以簡述為，在好氧反硝化過程中，有機(jī)碳源為電子供體，氧、亞硝酸鹽和硝酸鹽均為電子受體，最終硝酸鹽類被轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮;這一過程中起作用的酶為硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶.因此好氧反硝化的特點(diǎn)可以歸納為：①反硝化過程在好氧條件下進(jìn)行可實(shí)現(xiàn)同步硝化反硝化;②硝化產(chǎn)物可以直接作為反硝化底物被利用以避免硝酸鹽類物質(zhì)的積累;③反硝化生成的OH-可以部分補(bǔ)充硝化作用消耗的堿度以維持pH的相對穩(wěn)定.
近年來，對好氧反硝化的研究主要集中在特定好氧反硝化菌株的分離和其反硝化特性的研究，但特定菌株的反硝化特性與碳源類型、碳氮比、溫度、溶解氧和pH等因素有關(guān);而且不同氮源也影響菌株的反硝化特性.從可能的工程實(shí)際應(yīng)用角度考慮，對好氧反硝化菌群整體和其反硝化特征應(yīng)進(jìn)一步研究是有必要的，本論文的研究目的即在于此.在先前的連續(xù)流A/O流離反應(yīng)器同步硝化反硝化研究過程中發(fā)現(xiàn)，好氧反硝化過程在同步硝化反硝化中起到非常重要的作用，研究結(jié)果也證明了好氧反硝化菌的存在.因此有必要以整體菌群為研究對象，在特定水環(huán)境條件下對不同氮源對功能細(xì)菌的活性影響和反硝化特征進(jìn)行研究，使好氧反硝化菌和好氧反硝化作用在污水治理中具有實(shí)際應(yīng)用的可能性.
2 材料與方法
2.1 試驗(yàn)裝置
圖 1為采用流離生物技術(shù)的一套小型流離生物膜反應(yīng)器.反應(yīng)器為單格室，有效容積3.2 L，格室結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)19的A/O流離反應(yīng)器單一格室類似，填料是取自A/O反應(yīng)器好氧區(qū)內(nèi)的流離球，流離球直徑.反應(yīng)器下部出水，上部進(jìn)水，蠕動(dòng)泵控制.采用底部曝氣盤曝氣，曝氣量控制和計(jì)量采用微電腦曝氣裝置控制，通過探頭精確測量和微調(diào)，實(shí)現(xiàn)試驗(yàn)所要求的富氧水環(huán)境條件.溫度控制采用加熱棒實(shí)現(xiàn).
圖1 小型流離生物膜反應(yīng)器示意圖
流離現(xiàn)象的解釋：流體在流動(dòng)中總存在著不同的流速快和流速慢的場所，固體物和有機(jī)物膠體在流體的流動(dòng)中，總是由流速快的一側(cè)向流速慢的一側(cè)集中聚集，這種現(xiàn)象稱之為“流離”.流離生化處理技術(shù)即是在無壓力、只需水體稍微流動(dòng)、填料為表面經(jīng)過特殊處理的材料的集合體(流離球)中實(shí)現(xiàn).污水在流動(dòng)中存在著球體外流速快，球體內(nèi)流速慢的狀況，污水中漂浮物集中在流速慢的地方產(chǎn)生流離現(xiàn)象.經(jīng)過無數(shù)次流離作用，使污水中的固體物和有機(jī)物膠體與水分離，再結(jié)合生化分解，構(gòu)成了流離生化技術(shù).試驗(yàn)用反應(yīng)器即依照該原理構(gòu)建、運(yùn)行.
試驗(yàn)用水分別為低碳氮比廢水(以氨氮為氮源的廢水)、硝酸鹽廢水和亞硝酸鹽廢水.低碳氮比廢水采用自來水投加醋酸鈉、氯化銨、磷酸二氫鉀配制;硝酸鹽和亞硝酸鹽配水采用自來水投加氯化銨、硝酸鉀、亞硝酸鈉配制模擬高碳氮比廢水，藥劑投加量以滿足試驗(yàn)要求的濃度范圍為準(zhǔn).分類水質(zhì)和控制溫度如表 1所示.
表1 試驗(yàn)原水水質(zhì)和溫度條件
2.2 常規(guī)分析方法
水樣測定前經(jīng)0.45 μm濾紙過濾，NH4+-N、NO2--N、NO3--N依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(國家環(huán)境保護(hù)總局，2002)，TN和TC、TOC、TIC使用vario TOC設(shè)備(Elementar，德國)測定.DO、pH、溫度采用在線探頭監(jiān)測(WTW，德國).
2.3 16S rDNA提取、PCR擴(kuò)增、克隆測序及系統(tǒng)發(fā)育分析
DNA提取采用上海生工生產(chǎn)的試劑盒，PCR擴(kuò)增所用引物如表 2所示.
表2 PCR擴(kuò)增探針
反硝化菌使用引物nirS1F和nirS6R對反硝化菌進(jìn)行擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：5 μL的10×PCR buffer，dNTP(各2.5 mmol · L-1)2 μL，nirS1F(20 μmol · L-1)1 μL，nirS6R(20 μmol · L-1)1 μL，Taq酶(5U)1 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O至50 μL.PCR采用降落式擴(kuò)增程序，具體反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃;95 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行10個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min.
對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化，將PCR回收產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞，最后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選.挑取陽性克隆子，送往上海生工進(jìn)行測序.將所得序列利用BLAST程序與GenBank中已登錄的序列進(jìn)行同源性比較，并利用MEGA4.0軟件中的鄰接算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.
2.4 熒光原位雜交技術(shù)(FISH)
FISH技術(shù)用于分析活性細(xì)菌的相對數(shù)量以達(dá)到判斷系統(tǒng)運(yùn)行狀況的目標(biāo).氨氧化菌采用NSO1225(CGCCATTGTATTACGTGTGA)探針、亞硝化菌采用NIT3(CCTGTGCTCCATGCTCCG)探針檢測(Schmid et al., 2000).雜交步驟如下：
(1)污泥取樣：流離填料經(jīng)超聲后將剝離的污泥取2～5 mL至離心管，2000 r · min-1離心5 min，去上清液(加蒸餾水重復(fù)兩次);樣品加入1 mL多聚甲醛并搖勻，4 ℃下放置3 h.樣品12000 r · min-1離心5 min，去上清夜;加入1×PBS搖勻，10000 r · min-1離心5 min，去上清夜(重復(fù)3次);加0.5 mL的1×PBS、0.5 mL無水乙醇，搖勻后-20 ℃保存.
(2)樣品固定：稀釋樣品3~5倍，對樣品進(jìn)行超聲處理，將污泥絮體打散成單個(gè)細(xì)胞以便于顯微鏡計(jì)數(shù).然后取3 μL樣品涂于包埋明膠的玻片上(檢查樣片本底)，37 ℃的熱烘箱固定2 h.依次用質(zhì)量比50%、80%、98%的乙醇浸漬3 min，對細(xì)胞進(jìn)行脫水并干燥.
(3)樣品雜交：吸取2 mL雜交緩沖液遍布在雜交盒內(nèi)折好的吸水紙上，將已固定好樣品的載玻片放入雜交管中，然后在46 ℃雜交爐中放置數(shù)min;吸取10 μL探針貯存液和80 μL雜交緩沖液(Hybridization Buffer，HB和Washing Buffer，WB)，混合后用箔紙包好放入46 ℃雜交爐中預(yù)熱數(shù)min;探針貯存液濃度為25 ng · μL-1，用無菌水稀釋購買的探針，吸取9 μL預(yù)熱后的探針稀釋液涂于載玻片待測樣品上，然后將載玻片迅速地移回雜交管中于46 ℃下進(jìn)行雜交2~3 h;雜交后打開恒溫水浴槽，加熱到48 ℃，對雜交緩沖液、淋洗緩沖液進(jìn)行預(yù)熱.雜交盒中取出載玻片用雜交緩沖液沖洗樣品后，快速放入淋洗緩沖液，48 ℃水浴20 min后用4 ℃冰水沖洗樣品，樣品潔凈臺(tái)中揮干.
(4)封片觀察：涂封片劑，蓋蓋玻片，無氣泡后指甲油封裝;用帶有360 nm激發(fā)波長、460 nm發(fā)射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞.
3 試驗(yàn)結(jié)果與討論
3.1 低碳氮比廢水好氧反硝化研究
3.1.1 反應(yīng)器運(yùn)行狀態(tài)
圖 2a所示為反應(yīng)器內(nèi)持續(xù)24 h的DO和pH變化趨勢.由于好氧反硝化菌對DO濃度不敏感，維持較高DO濃度并不影響好氧反硝化菌的生長和活性.同時(shí)pH并未出現(xiàn)大的波動(dòng)，在整個(gè)試驗(yàn)過程中始終維持在7.0~8.0之間，這一pH范圍適宜硝化菌和反硝化菌的生存，偏堿性環(huán)境表明存在較好的反硝化作用.溫度穩(wěn)定控制在25~30 ℃.
圖2 運(yùn)行參數(shù)和物質(zhì)濃度變化趨勢
3.1.2 物質(zhì)去除過程分析
低碳氮比廢水可以看作以氨氮為主要氮源的廢水.圖 2b和2c分別為氮類物質(zhì)和碳類物質(zhì)去除及轉(zhuǎn)化趨勢.由圖 2b可知，總氮和氨氮濃度沿反應(yīng)時(shí)間逐漸下降，曲線斜率大于城市污水試驗(yàn);亞硝酸鹽和硝酸鹽在反應(yīng)進(jìn)行10 h后出現(xiàn)少量積累，硝酸鹽積累量小于亞硝酸鹽.對應(yīng)圖 2c，有機(jī)碳濃度在0~10 h之間快速降低，而無機(jī)碳變化幅度相對很小.這一趨勢表明，0~10 h內(nèi)的氨氮去除可能來自異養(yǎng)硝化作用，好氧反硝化作用將硝化作用生成的硝酸鹽類物質(zhì)去除.原因如下：一是由于部分好氧反硝化菌也是異養(yǎng)硝化菌，在低碳氮比污水脫氮過程中，異養(yǎng)硝化菌與自養(yǎng)硝化菌競爭氮源，氨氮的去除主要由異養(yǎng)硝化菌完成，因此有機(jī)碳被大量消耗，而無機(jī)碳濃度下降趨勢小于有機(jī)碳.二是可能同時(shí)存在亞硝酸鹽還原酶和硝酸鹽還原酶，硝化過程產(chǎn)生的硝酸鹽類物質(zhì)在高活性亞硝酸鹽還原酶和硝酸鹽還原酶作用下被迅速還原.試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，1~2 h的氨氮有突降，可能是存在某種自養(yǎng)硝化菌使少量氨氮在試驗(yàn)初期被直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮去除，但暫時(shí)缺乏試驗(yàn)支持，需進(jìn)一步研究.總之，0~10 h反應(yīng)器內(nèi)出現(xiàn)了同步硝化反硝化現(xiàn)象，而且主要可能來自異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用.
在10~24 h階段，圖 2c顯示有機(jī)碳下降趨勢基本結(jié)束，但是無機(jī)碳濃度開始下降.對應(yīng)圖 2b所示，10~24 h氨氮濃度繼續(xù)下降，硝酸鹽和亞硝酸鹽開始產(chǎn)生小幅度的積累.分析原因：一是由于有機(jī)碳被大量消耗后，異養(yǎng)硝化菌的增殖受到碳源不足的影響，活性降低;而自養(yǎng)硝化菌增殖速度加快，活性增強(qiáng)，對無機(jī)碳源的消耗增大，表明這一階段的氨氮去除主要來自自養(yǎng)硝化作用.二是由于有機(jī)碳源的不足使好氧反硝化菌對硝酸鹽類物質(zhì)的去除能力也被削弱;但是由于自養(yǎng)硝化菌可以利用NH3氧化的能量還原CO2為有機(jī)碳供生命活動(dòng)，一定程度上也補(bǔ)充了有機(jī)碳的消耗，好氧反硝化菌可以繼續(xù)保持一定的反硝化作用，但反硝化程度受限，因此可能導(dǎo)致硝酸鹽類物質(zhì)的小幅積累現(xiàn)象.三是亞硝酸鹽是硝酸鹽反硝化過程的中間產(chǎn)物，其濃度過高易對硝酸鹽還原為亞硝酸鹽這一步驟產(chǎn)生抑制作用，從而降低硝酸鹽的還原量，但亞硝酸鹽濃度達(dá)到多少即影響硝酸鹽的還原，目前暫時(shí)無數(shù)據(jù)支撐.而硝酸鹽的少量積累，表明亞硝酸鹽積累的濃度已經(jīng)達(dá)到影響好氧反硝化菌對硝酸鹽反硝化能力的程度.
在連續(xù)24 h的低碳氮比好氧反硝化研究中，反應(yīng)階段被分為異養(yǎng)硝化-好氧反硝化和自養(yǎng)硝化-好氧反硝化兩階段，但均符合同步硝化反硝化特征.根據(jù)計(jì)算可知，0~10 h的同步硝化反硝化率為79.40%，10~24 h的同步硝化反硝化率為81.25%.
3.1.3 熒光原位雜交試驗(yàn)
以上的好氧反硝化特征分析以及少量的硝酸鹽類物質(zhì)積累現(xiàn)象依舊存在一個(gè)問題，就是觀察到的亞硝酸鹽積累是否一定來自好氧反硝化能力被削弱才產(chǎn)生的，還是由自養(yǎng)硝化作用生成，這需要通過其它研究手段來判斷.圖 3為第23 h的氨氧化菌(AOB)和亞硝化菌(NOB)的相對數(shù)量對比，放大倍數(shù)為120倍.從綠色光電數(shù)量來看，二者活性菌數(shù)量基本接近，說明亞硝酸鹽出現(xiàn)積累并不是來自自養(yǎng)硝化作用，而是好氧反硝化菌反硝化能力受限，亞硝酸還原酶活性被抑制進(jìn)而影響了亞硝酸的還原，因此出現(xiàn)小幅積累現(xiàn)象.
圖3 AOB和NOB相對數(shù)量比較
3.2 以硝酸鹽為氮源廢水的好氧反硝化研究
3.2.1 物質(zhì)去除過程與分析
圖 4a和4b分別為氮類物質(zhì)和碳類物質(zhì)去除及轉(zhuǎn)化趨勢.由圖 4a可知，在0~6 h階段，硝酸鹽緩慢下降而亞硝酸鹽在開始小幅上升后即基本不變.這一階段變化表明，由于流離填料取自城市污水反應(yīng)器，原水的氮源特征發(fā)生改變，好氧反硝化菌需要調(diào)整以適應(yīng)新的氮源環(huán)境;而亞硝酸鹽未產(chǎn)生積累可能是亞硝酸鹽還原酶在硝酸鹽還原酶同時(shí)存在時(shí)具有較高的反應(yīng)活性，經(jīng)硝酸鹽還原酶產(chǎn)生的亞硝酸鹽在較高活性的亞硝酸鹽還原酶作用下被迅速還原;同時(shí)這一階段有機(jī)碳的消耗量也較低(圖 4b).
圖4 物質(zhì)濃度和運(yùn)行參數(shù)變化趨勢
圖 4a所示，在6~9 h階段，硝酸鹽被迅速去除，濃度從22.16 mg · L-1降低到3.80 mg · L-1;在9~14 h階段，硝酸鹽去除趨勢減緩，曲線斜率遠(yuǎn)小于6~9 h階段;直到17 h時(shí)，硝酸鹽去除率達(dá)到100%.與之對應(yīng)的是，在6~13 h階段，亞硝酸鹽開始出現(xiàn)積累，濃度從1.24 mg · L-1升高至16.76 mg · L-1;緊接著在13~14 h，亞硝酸鹽去除至0.84 mg · L-1，去除率接近100%.另外如圖 4b所示，在硝酸鹽去除和亞硝酸鹽積累并進(jìn)而快速去除這一階段，有機(jī)碳消耗接近100%，表明在好氧反硝化菌作用下，硝酸鹽類物質(zhì)和有機(jī)碳被消耗.但是在硝酸鹽去除過程中發(fā)生了明顯的亞硝酸鹽積累，積累量是硝酸鹽還原量的72.80%，這與一些研究發(fā)現(xiàn)的硝酸鹽去除過程中無亞硝酸鹽積累的結(jié)果相反.分析原因是，亞硝酸還原酶承擔(dān)將亞硝酸鹽還原的功能，但亞硝酸鹽在溶液中會(huì)產(chǎn)生游離亞硝酸(FNA)，F(xiàn)NA有較強(qiáng)的生物毒性，對微生物的生長代謝產(chǎn)生抑制作用.這可以解釋為什么硝酸鹽的快速去除過程在9 h后被終止，9 h后基本是緩慢去除過程.另外，好氧反硝化菌也需要合成多種酶和細(xì)胞組分以適應(yīng)新出現(xiàn)的亞硝酸鹽環(huán)境.當(dāng)菌群適應(yīng)新的氮源后，僅在1 h內(nèi)亞硝酸鹽去除率即接近100%.
3.2.2 反應(yīng)器運(yùn)行狀態(tài)
試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，整個(gè)反應(yīng)過程中無機(jī)碳濃度明顯升高，這也許可以從圖 4c中找到原因.圖 4c為反應(yīng)器內(nèi)持續(xù)18 h的溫度、溶解氧和pH的變化趨勢.pH呈逐漸上升趨勢，從試驗(yàn)開始的7.80升至試驗(yàn)結(jié)束的8.53;而隨著pH值的升高，水中溶解的CO2增多，無機(jī)碳也相應(yīng)升高.另外，為考察高溫條件下好氧反硝化菌的適應(yīng)能力，溫度在試驗(yàn)全程維持較高水平，同時(shí)也使CO2的溶解性提高，進(jìn)一步提高了水中無機(jī)碳的濃度，與圖 4b中的無機(jī)碳濃度變化趨勢符合.溶解氧在6~14 h內(nèi)波動(dòng)明顯，與這一時(shí)間段硝酸鹽和亞硝酸鹽的快速去除也相吻合，表明好氧反硝化菌在去除硝酸鹽類物質(zhì)時(shí)，作為電子受體的O2也同時(shí)被還原.
3.3 以亞硝酸鹽為氮源廢水的好氧反硝化研究
3.3.1 物質(zhì)去除過程與分析 圖 5a和5b分別為氮類物質(zhì)和碳類物質(zhì)去除及轉(zhuǎn)化趨勢.由圖 5a可知，在0~3 h階段，亞硝酸鹽濃度由20.92 mg · L-1降至13.26 mg · L-1，硝酸鹽濃度由9.20 mg · L-1升至17.16 mg · L-1.這是由于亞硝酸鹽濃度較高時(shí)誘導(dǎo)了亞硝酸氧化酶，將部分亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽(張培玉等，2010);亞硝酸鹽被氧化的量比硝酸鹽的增加量少0.3 mg · L-1，表明有極少量的亞硝酸鹽被好氧反硝化菌還原，這與圖 5b中這一時(shí)間段有機(jī)碳的少量消耗相符.
圖5 物質(zhì)濃度和運(yùn)行參數(shù)變化趨勢
在3~6 h階段，亞硝酸鹽濃度微下降，硝酸鹽濃度小幅上升.6~7 h內(nèi)硝酸鹽濃度大幅度下降，去除率達(dá)到80%以上，同時(shí)亞硝酸鹽濃度升至高點(diǎn).分析原因，一是由于硝酸鹽具有較高的氧化還原電位，利用其作為電子受體時(shí)基質(zhì)釋放的能量較高;另外Frette等認(rèn)為理論上硝酸鹽還原產(chǎn)生的能量是亞硝酸鹽還原產(chǎn)生能量的3.8倍，根據(jù)優(yōu)先利用原則，當(dāng)水中同時(shí)存在硝酸鹽和亞硝酸鹽時(shí)，反硝化菌優(yōu)先利用硝酸鹽進(jìn)行好氧反硝化.二是由于亞硝酸鹽是硝酸鹽反硝化過程的中間產(chǎn)物，其濃度過高時(shí)易對硝酸鹽還原為亞硝酸鹽這一步驟產(chǎn)生抑制作用，從而降低硝酸鹽的還原量，這可以解釋為什么硝酸鹽快速去除只持續(xù)了1 h就進(jìn)入緩慢去除過程，而這個(gè)時(shí)間點(diǎn)正是亞硝酸鹽濃度的高點(diǎn).說明過高的亞硝酸鹽濃度抑制了硝酸鹽的還原過程.隨后的7~14 h內(nèi)，硝酸鹽去除達(dá)到100%;隨著硝酸鹽的去除接近完成，亞硝酸鹽去除從13 h開始，1 h內(nèi)去除率即達(dá)到100%.如前所述，亞硝酸鹽產(chǎn)生的FNA有毒，好氧反硝化菌需要時(shí)間合成酶和細(xì)胞組分，這一過程持續(xù)了11 h.而且在同時(shí)存在硝酸鹽和亞硝酸鹽的環(huán)境中，二者去除的速度(總共14 h)比單一硝酸鹽(18 h)時(shí)更快.
在反應(yīng)過程中，部分時(shí)間點(diǎn)檢測到微量的氨氮存在.雖然少量的氨氮會(huì)促進(jìn)還原酶的合成和硝酸鹽類的去除，但氨氮只在部分時(shí)間點(diǎn)檢測到，無特定的規(guī)律，所以這種促進(jìn)作用是否存在于本試驗(yàn)研究中并不能確定.
3.3.2 反應(yīng)器運(yùn)行狀態(tài)
圖 5c為反應(yīng)器內(nèi)持續(xù)24 h的溫度、溶解氧和pH的變化趨勢.試驗(yàn)中，pH呈逐漸上升趨勢，從試驗(yàn)開始的7.71升至試驗(yàn)結(jié)束的8.41，表明反硝化作用在持續(xù)穩(wěn)定進(jìn)行.溶解氧在6~14 h內(nèi)波動(dòng)明顯，與這一時(shí)間段硝酸鹽和亞硝酸鹽的快速去除相吻合.表明好氧反硝化菌在去除硝酸鹽類物質(zhì)時(shí)，作為電子受體的O2也同時(shí)被還原，這與前文硝酸鹽為氮源的試驗(yàn)現(xiàn)象一致.
3.4 好氧反硝化菌的鑒定
污泥樣品取自好氧反硝化試驗(yàn)結(jié)束后的流離填料生物膜.圖 6為應(yīng)用反硝化菌基因片段和GenBank數(shù)據(jù)庫所獲得的反硝化菌系統(tǒng)發(fā)育樹. 檢測到的反硝化菌經(jīng)文獻(xiàn)比對得知：其中FN555565.1、 FN555559.1、FN555558.1，AY078272.1、AY078256.1、AM230913.1、AM230896.1為好氧反硝化菌;GQ384052.1、EF558380.1、EF558490.1為異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌;其它細(xì)菌暫時(shí)為性狀不明的反硝化菌，暫時(shí)無文獻(xiàn)比對結(jié)果.鑒定結(jié)果表明，隨著水環(huán)境中氮源類型的變化，流離填料生物膜內(nèi)好氧反硝化菌的種屬發(fā)生變化以適應(yīng)新氮源環(huán)境，與本試驗(yàn)研究開始時(shí)所用的流離填料生物膜內(nèi)的菌屬有一定區(qū)別;部分菌群具備異養(yǎng)硝化能力，可以解釋在處理低碳氮比廢水時(shí)0~10 h內(nèi)總氮和有機(jī)碳源變化趨勢的相關(guān)性.具體參見污水寶商城資料或http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
圖6 反硝化菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹
4 結(jié)論
研究了生物膜內(nèi)功能菌群為整體研究好氧反硝化特征.在低碳氮比廢水的試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)階段被分為異養(yǎng)硝化-好氧反硝化和自養(yǎng)硝化-好氧反硝化兩階段，但均符合同步硝化反硝化特征.在以硝酸鹽和亞硝酸鹽分別為氮源的廢水反硝化試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，好氧反硝化菌對氮源的利用有先后之分;硝酸鹽去除過程中會(huì)出現(xiàn)亞硝酸鹽的積累，這是不同還原酶之間相互抑制的作用.在亞硝酸鹽和硝酸鹽同時(shí)存在條件下，二者去除速率(14 h)比單一硝酸鹽(18 h)的去除更快;好氧反硝化菌對氮源的改變有一個(gè)適應(yīng)過程.以上結(jié)論均在高溫(>40 ℃)條件下得出.綜上，以整體菌群代替單一菌株的好氧反硝化試驗(yàn)研究，并在相對惡劣的水環(huán)境下進(jìn)行，有助于考察好氧反硝化菌應(yīng)用于實(shí)際污水處理設(shè)施中的可能性.
