高效液相色譜法測(cè)定廢水中泰樂菌素殘留量

　　隨著環(huán)保意識(shí)的逐漸增強(qiáng)，人們?cè)絹碓疥P(guān)注抗生素在環(huán)境中的積蓄 、轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化和對(duì)各種生物及人類健康的影響，成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn) 。 泰樂菌素是十六環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，為畜禽專用抗生素藥 物 ，對(duì)革蘭氏陽性菌和支原體有較強(qiáng)的抑制能力〔1〕。當(dāng)含有泰樂菌素的藥廠廢水 不加檢控處理，直接進(jìn)入河流、湖泊等水環(huán)境時(shí)，將在水產(chǎn)動(dòng)物肌體內(nèi)積蓄，使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性 。如果這種抗藥性轉(zhuǎn)移給感染人的細(xì)菌，會(huì)導(dǎo)致針對(duì)人細(xì)菌的抗生素效力降低或失去抗菌作用〔2〕。因此對(duì)廢水中的抗生素含量進(jìn)行檢測(cè)控制勢(shì)在必行。目前在抗生素類藥物的殘留檢測(cè)方面已有一定成就，仲曉寧等〔3〕建立了雙波長(zhǎng)紫外分光光度法，同時(shí)測(cè)定酒石 酸泰樂菌素 -鹽酸多西環(huán)素可溶性粉中的酒石酸泰樂菌素和鹽酸多西環(huán)素含量 ; 楊方等〔4〕利用高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中的螺旋霉素和泰樂菌素藥物殘留; M. Dubois 等〔5〕和趙東豪等〔6〕分別建立了HPLC -MS/MS 檢測(cè)各種組織( 肌肉 、腎臟和肝臟)、蛋和牛奶中5 種大環(huán)內(nèi)酯類藥物及豬肉中 6 種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的方法 ; 劉志梅等〔7〕提出了中空纖維液相微萃取—高效液相色譜法測(cè)定牛奶中 3 種殘留抗生素。泰樂菌素生產(chǎn)工藝是我國(guó)制藥行 業(yè)近幾年才從國(guó)外引進(jìn)的，目前對(duì)藥廠廢水中殘留的泰樂菌素如何檢控與檢測(cè)尚未見報(bào)道。筆者在兼顧我國(guó)質(zhì)檢機(jī)構(gòu)裝備水平的基礎(chǔ)上，應(yīng)用 HPLC 結(jié)合固相萃取技術(shù)對(duì)廢水中泰樂菌素的檢測(cè)方法進(jìn)行了研究 ，建立一種穩(wěn)定 、簡(jiǎn)便、快捷的檢測(cè)方法。

　　1 實(shí)驗(yàn)部分

　　1.1 儀器與試劑

　　儀器： 1010 型高效液相色譜儀，上海通威分析技術(shù)有限公司 ; MGS-2200 氮吹儀 ，日本東京理化器械 株 式 會(huì) 社 ; 固 相 萃 取 柱 ，ODS-SPE spec (500 mg， 6 mL)，Angele 公司 ; Scholar NEX power1000 超純水處理器，北京普析通用儀 器有限責(zé)任公司 ; 色譜柱 ， Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

　　試劑 ： 乙腈 、乙醇 、甲醇 、皆為色譜純 ; 磷酸 、磷酸二氫鈉，為優(yōu)級(jí)純 ; 泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品 ，德國(guó) Dr. Ehren- storfer 公司 ; 實(shí)驗(yàn)用水為去離子水 。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱取0.1g(精確到 0.0001g)泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容于 100mL棕色容量瓶中，搖勻。此溶液質(zhì)量濃度為 1g/L，置于冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/P>

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋至質(zhì)量濃度為10mg/L。分別移取稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0mL于容量瓶中，用水定容至10mL，以約2mL/min的速度分別通過固相萃取柱。待溶液全部流出后以10mL水淋洗，棄去淋洗液，繼續(xù)減壓抽干5min，以10mL甲醇洗脫柱上的吸附物并收集于小試管中，在氮吹儀上將洗脫液吹干，用流動(dòng)相定容1mL，待測(cè)。

　　固相萃取柱活化：將固相色譜柱置于固定架上，加入10mL甲醇，待甲醇流完后用10mL二次蒸餾水沖洗兩次。

　　廢水樣品的測(cè)定：將新采集的廢水水樣用孔徑 0.45μm微濾膜過濾后，視廢水中的泰樂菌素濃度取一定量的濾液通過固相萃取柱，采用與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制相同的方法進(jìn)行處理。

　　液相色譜工作條件：流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(0.5% 磷酸)=90∶10;紫外檢測(cè)器測(cè)定波長(zhǎng)為282nm;流動(dòng)相流速為1mL/min;柱溫為30℃。

　　2 結(jié)果與討論

　　2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

　　準(zhǔn)確移取1.5mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于容量瓶中，用水定容至50mL，用此泰樂菌素溶液進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見圖1。

 圖 1 泰樂菌素光譜掃描

　　實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)為282nm處待測(cè)組分有最大吸光度，同時(shí)對(duì)所用溶劑甲醇進(jìn)行掃描，其最大吸收波長(zhǎng)為197nm，在282nm處基本無吸收，因此本實(shí)驗(yàn)選擇282nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

　　2.2 流動(dòng)相及其比例選擇

　　實(shí)驗(yàn)選用了兩種流動(dòng)相體系：(1)乙腈+0.5%磷酸;(2)乙腈+0.005mol/L磷酸二氫鈉。流動(dòng)相中各組分的體積比為：V(乙腈)∶V(0.5%磷酸)〔或V(乙腈)∶V(0.005mol/L磷酸二氫鈉)〕=100∶0、95∶5、90∶10、 85∶15、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50，流速為1mL/min，待測(cè)樣品中泰樂菌素質(zhì)量濃度為2mg/L。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相體系(1)的響應(yīng)信號(hào)大于體系(2)，且當(dāng)乙腈與 0.5%磷酸的體積比為90∶10時(shí)峰形尖銳，響應(yīng)信號(hào)峰形及分離度較好，因此實(shí)驗(yàn)選用流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(0.5%磷酸)=90∶10。

　　2.3 洗脫劑的選擇

　　選用了4種洗脫劑：8.76mmol/L H3PO4-甲醇溶液、8.76mmol/L H3PO4-乙腈溶液、甲醇及乙腈進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將10mL泰樂菌素質(zhì)量濃度為2mg/L的水樣通過固相色譜柱，分別用10mL上述4種洗脫劑進(jìn)行洗脫。洗脫液用氮?dú)獯蹈珊笥靡译嫒芙�、定容�?1mL，用HPLC測(cè)定峰面積，結(jié)果見表1。

　　由表1可見，甲醇為洗脫劑時(shí)對(duì)待測(cè)組分的洗脫效果較好。

　　2.4 洗脫劑用量的選擇

　　取10mL泰樂菌素廢水樣品(泰樂菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2mg/L)各4份，按1.2所述方法進(jìn)行處理，分別用2.00、5.00、10.00、15.00mL甲醇洗脫，在選定的液相色譜工作條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

　　由表2可以看出，當(dāng)洗脫劑甲醇的用量為 10.00mL和15.00mL時(shí)，洗脫效果相差不大，考慮到減少有機(jī)溶劑的用量，實(shí)驗(yàn)采用10mL甲醇洗脫待測(cè)物。

　　2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

　　按1.2所述方法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液系列并在選定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線及泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜見圖2和圖3。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好， R2=0.9993，y=56340x-1248.9，其線性范圍為0.2~ 5mg/L。按3倍信噪比計(jì)算出該方法的檢出限為 0.0887mg/L。

圖 2 泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線

 
圖 3 泰樂菌素標(biāo)樣色譜

　　2.6 準(zhǔn)確度與精密度實(shí)驗(yàn)

　　準(zhǔn)確移取20mL水樣，分別加入不同量的泰樂菌素標(biāo)樣，按1.2所述方法處理水樣并進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)采用的泰樂菌素測(cè)定方法準(zhǔn)確度較好。

 　　2.7 污水樣品測(cè)定

　　采集寧夏某藥廠的廢水排放口水樣(pH=7.8，總氮為47.7mg/L)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果見表4、圖4。具體參見http://www.yiban123.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

 圖 4 水樣1的液相色譜

　　3 結(jié)論

　　提出了用ODS-SPE固相萃取柱分離濃縮、高效液相色譜測(cè)定污水中泰樂菌素的方法。該方法操作簡(jiǎn)便，快速準(zhǔn)確。用其測(cè)定藥廠廢水中的泰樂菌素含量時(shí)得到了較滿意的結(jié)果。