微生物絮凝劑產(chǎn)生菌絮凝活性研究

摘 要：從福州郊區(qū)旱田地表土壤中分離得到一株絮凝劑產(chǎn)生菌，根據(jù)菌落形態(tài)特征，初步鑒定為鏈球菌。研究表明，培養(yǎng)基組成如下：碳源為蔗糖，氮源為牛肉膏，培養(yǎng)基初始 pH 值為 5 ~ 8.5之間能取得較好的效果，添加一定濃度的 Na+、Mg2 、Ca2 對(duì)培養(yǎng)液的絮凝活性有促進(jìn)作用，而培養(yǎng)液中少量的 Cu2 、Fe3 、Zn2 可抑制絮凝活性，該絮凝劑對(duì)高嶺土懸浮液有較好的絮凝效果。結(jié)合實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和雙電層理論初步推測(cè)了該絮凝劑的絮凝過(guò)程模型，對(duì)進(jìn)一步研究微生物絮凝劑的絮凝機(jī)理有一定的參考作用。

關(guān)鍵詞：微生物  絮凝劑 絮凝活性

微生物絮凝劑是微生物在其代謝過(guò)程中分泌的能使液體中不易沉降的固體顆粒凝集，繼而沉降的高分子物質(zhì)。微生物絮凝劑不僅具有傳統(tǒng)絮凝劑的特性，因其成分為糖蛋白、多糖、蛋白質(zhì)、核酸等，具有可生物降解、無(wú)二次污染等獨(dú)特性質(zhì)，已被應(yīng)用于高濃度有機(jī)廢水、粉煤灰、高嶺土、泥漿水與印染廢水等的處理工藝中，被認(rèn)為是繼無(wú)機(jī)絮凝劑、有機(jī)絮凝劑之后的一種新型的絮凝劑。

微生物絮凝劑研究目前主要集中在微生物的篩選、發(fā)酵條件的優(yōu)化、分離純化、分子結(jié)構(gòu)的解析、絮凝作用機(jī)理、絮凝條件的應(yīng)用、通過(guò)現(xiàn)代基因技術(shù)組建工程菌等方面。

本研究報(bào)道一株土壤中分離得到的鏈球菌所產(chǎn)微生物絮凝劑的絮凝特性，并從絮凝劑的產(chǎn)生條件和絮凝條件角度探討了微生物絮凝劑在不同培養(yǎng)條件和絮凝條件下對(duì)高嶺土懸浮液的絮凝效果，并嘗試根據(jù)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象結(jié)合雙電層理論解釋提出該絮凝劑的絮凝過(guò)程簡(jiǎn)單模型，對(duì)進(jìn)一步研究微生物絮凝劑的絮凝機(jī)理有一定的參考作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 微生物的篩選與分離

取福州近郊旱田黑色地表土作為培養(yǎng)來(lái)源。將不同懸浮液在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁，菌懸浮液劃線涂布于固體培養(yǎng)基表面，觀察菌落形態(tài)為蛋清狀的菌落挑取后經(jīng)斜面培養(yǎng)多次劃線分離、初步純化，直至稀釋劃線后接連幾次培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出的菌落特征相同，初步認(rèn)為菌株純化較完全，編號(hào)低溫保存。為防止污染，本試驗(yàn)需在凈化工作臺(tái)進(jìn)行，委托福建省防疫站對(duì)菌株進(jìn)行分類鑒定。

絮凝活性測(cè)定：5 g/L的高嶺土溶液調(diào)節(jié)pH后取50 mL至燒杯中，加入0.5 mL接種微生物的發(fā)酵液樣品，用磁力攪拌器攪拌0.5 min，靜止3 min后吸取上層清液于550 nm處測(cè)定吸光值B，空白組為液體培養(yǎng)基代替樣品測(cè)定吸光值A(chǔ)。

1.2 微生物最適碳源、氮源的篩選

選用不同碳源、氮源在相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察絮凝活性的變化，確定適宜的碳源、氮源。

1.3 絮凝劑的培養(yǎng)條件的優(yōu)化

研究培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度、不同無(wú)機(jī)離子種類對(duì)絮凝活性的影響，確定產(chǎn)絮凝劑的基本培養(yǎng)條件。

1.4 微生物絮凝劑的絮凝特性

研究絮凝對(duì)象中金屬離子種類和濃度等對(duì)絮凝效果的影響。并依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)絮凝過(guò)程的簡(jiǎn)單模型。

2 結(jié)果與討論

從福州旱田土壤中篩選得到一株產(chǎn)絮凝劑微生物，該微生物菌落在培養(yǎng)基平板上有明顯的產(chǎn)莢膜微生物形態(tài)特點(diǎn)，參見表1。

夾膜或粘液層是某些細(xì)菌的細(xì)胞表面上產(chǎn)生的一層松散的粘液性物質(zhì)。莢膜（capsule）具有一定的外形，相對(duì)穩(wěn)定地吸附于細(xì)胞壁外；粘液層（slime layer）則無(wú)明顯的邊緣可擴(kuò)散到周圍環(huán)境中。細(xì)菌莢膜和粘液層的主要成分為多糖、多肽、蛋白質(zhì)，也有少量為DNA，這些化學(xué)成分與已發(fā)現(xiàn)的微生物絮凝劑的成分基本一致。本研究所發(fā)現(xiàn)的微生物絮凝劑經(jīng)分離純化后，主要成分為酸性多糖，詳細(xì)研究結(jié)果另文報(bào)道。

2.1.1 碳源對(duì)絮凝活性的影響

以牛肉膏、K2HPO4、少量金屬離子為單因子基礎(chǔ)培養(yǎng)基，根據(jù)可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、甘油、甘露醇、乙醇物質(zhì)中碳元素含量計(jì)算應(yīng)添加碳源質(zhì)量，以不加碳源為對(duì)照，碳源實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

實(shí)驗(yàn)表明，不同碳源的選擇變化強(qiáng)烈影響絮凝活性。蔗糖作為碳源時(shí)培養(yǎng)液表現(xiàn)出最佳的絮凝活性，其次為葡萄糖；可溶性淀粉由于本身的溶解度原因反而使?jié)岫壬仙�，其他如甘油等作為碳源時(shí)的絮凝活性小于30%。

2.1.2 培養(yǎng)基中氮源對(duì)絮凝活性的影響

以蔗糖，KH2PO4為單因子基礎(chǔ)培養(yǎng)基，根據(jù)氯化銨、尿素、牛肉膏、硝酸銨、硝酸鈉、酵母膏、蛋白胨物質(zhì)中氮元素含量計(jì)算應(yīng)添加的氮源質(zhì)量，不加氮源為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采用了不同的氮源，培養(yǎng)液對(duì)高嶺土都有一定的絮凝活性（＞50%）。牛肉膏、氯化銨組絮凝活性最高，尿素最低。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，菌體的生長(zhǎng)與絮凝劑的活性有一定的相關(guān)性。菌體生長(zhǎng)較好的，絮凝活性也較好；反之則較差。

比較碳源與氮源對(duì)絮凝活性的影響發(fā)現(xiàn)：碳源變化對(duì)絮凝活性的影響大于氮源。這可能是因?yàn)槲⑸�物所合成的絮凝劑主要依賴于微生物從培養(yǎng)基中的糖類獲得，當(dāng)環(huán)境中不存在合成絮凝劑所需要的基本“原料”時(shí)，微生物難以有效合成、分泌絮凝活性物質(zhì)，甚至影響微生物自身的生長(zhǎng)。Yokoi等研究發(fā)現(xiàn)：Enterbacter sp. 所產(chǎn)生含有蛋白質(zhì)組分的絮凝劑的絮凝活性受到培養(yǎng)基中氮源的影響較碳源大，這一現(xiàn)象可能與培養(yǎng)基中的氮源參與絮凝劑的微生物合成過(guò)程有關(guān)。

2.1.3 培養(yǎng)基中金屬離子對(duì)絮凝活性的影響

在一定離子濃度條件下觀察不同離子對(duì)培養(yǎng)液絮凝活性的影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：Cu2+、Fe3+、Zn2+離子的存在對(duì)絮凝活性有的較強(qiáng)的抑制作用；而Na+、Mg2+、Ca2+對(duì)絮凝活性有促進(jìn)作用。在培養(yǎng)基中添加無(wú)機(jī)離子后，發(fā)酵培養(yǎng) 1d 后測(cè)定培養(yǎng)液絮凝活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 1。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看：培養(yǎng)基中添加 ZnCl2、FeCl3、CuCl2只要達(dá)到了 0.1%就將完全抑制絮凝活性的產(chǎn)生。FeCl3的存在使培養(yǎng)基有明顯的顏色，使絮凝活性表現(xiàn)為負(fù)值；添加 NaCl、MgCl2、CaCl2 使絮凝活性分別提高�？紤]到培養(yǎng)液中金屬離子對(duì)絮凝活性的測(cè)定產(chǎn)生干擾，確定培養(yǎng)基基本組成為：碳源 1%、氮源 0.4%、K2HPO40.04%MgSO40.02%、CaCl20.005%。

2.1.4 培養(yǎng)溫度對(duì)絮凝活性的影響

為確定絮凝劑產(chǎn)生的適宜培養(yǎng)溫度，其他條件相同的情況下，分別在不同的溫度下發(fā)酵培養(yǎng) 1 天，測(cè)定絮凝活性。

從表 4 可以看出微生物在溫度 20℃至 40℃條件下培養(yǎng)，所產(chǎn)生的絮凝活性都＞80%，溫度為 15℃或高于 40℃時(shí)絮凝

活性迅速下降。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在本實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)溫度為 30℃。

2.1.5 培養(yǎng)基起始 pH 值對(duì)絮凝活性的影響

在不同的 pH 值條件下，30℃發(fā)酵培養(yǎng)，并測(cè)定絮凝活性。結(jié)果見圖 2。在培養(yǎng)基起始 pH值為 4 至 9 的范圍內(nèi)微生物都能分泌絮凝活性物質(zhì)。當(dāng) pH 值低于 5.0 或高于 8.5，絮凝活性下降。由于培養(yǎng)基 pH 值約為 5.5，實(shí)驗(yàn)中調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH 值為 7 后進(jìn)行培養(yǎng)。

2.1.6 處理對(duì)象中金屬離子對(duì)絮凝活性的影響

EDTA溶液將高嶺土充分浸泡，抽濾、洗滌、烘干后配置成 pH = 12 的10g/L 的高嶺土懸浮液。在25mL的高嶺土溶液中分別加入0.5mL、NaCl、CaCl2、FeCl3溶液，再添加蒸餾水稀釋至50mL，使溶液中Na+、Ca2 、Fe3濃度為 2 mmol/L，加入 0.5mL 絮凝劑攪拌后，測(cè)定絮凝活性。空白為 EDTA 處理后高嶺土懸浮液。

在絮凝體系中添加 Na+、Ca2 能夠提高絮凝活性，而加入 Fe3 卻使絮凝活性明顯下降。對(duì)不同 Ca2 離子的進(jìn)一步研究表明：當(dāng)體系中 Ca2 濃度為 4 mmol 時(shí)絮凝活性最大，繼續(xù)加大 Ca2 濃度，絮凝活性緩慢下降。Kurane對(duì)金屬離子對(duì)高嶺土懸浮液絮凝影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入二價(jià)離子能夠改善絮凝劑對(duì)高嶺土懸浮液的絮凝效果，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

2.2 微生物絮凝劑絮凝機(jī)理的簡(jiǎn)單模型

一般認(rèn)為金屬離子的助凝作用來(lái)源于金屬離子對(duì)絮凝過(guò)程中凝聚作用和絮凝作用的共同參與。高嶺土懸濁液中投加金屬離子時(shí)，高嶺土顆粒可在電性中和與壓縮雙電層作用下，微粒脫穩(wěn)形成細(xì)小的凝聚體。這些細(xì)小的凝聚體在絮凝劑的吸附架橋作用下形成大絮體，從而出現(xiàn)沉降。

但綜合本實(shí)驗(yàn)和其它相關(guān)研究的結(jié)果來(lái)看，微生物絮凝過(guò)程中的一些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象無(wú)法用壓縮雙電層理論圓滿解釋。以下問(wèn)題有待討論：

（1）添加二價(jià)的離子比添加三價(jià)的離子能取得更好的絮凝效果。

（2）過(guò)高的 Ca2 離子濃度會(huì)使絮凝活性降低。

（3）絮凝劑與金屬離子協(xié)同促進(jìn)絮凝的過(guò)程。

Yokoi、Salehizadeh、李桂嬌都對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的該類現(xiàn)象作出了一些解釋。綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和其他研究者的研究結(jié)論，推測(cè)微生物絮凝劑的絮凝過(guò)程的可能步驟如下：

（1）溶液中少量金屬離子，作為一種“反號(hào)離子”，一方面受到懸浮顆粒表面電荷的庫(kù)侖力作用，聚集、壓縮了高嶺土顆粒表面的雙電層；另一方面受到絮凝劑內(nèi)部電離基團(tuán)的作用，被吸附并形成一種可流動(dòng)的反號(hào)離子層。

（2）懸浮顆粒與絮凝劑在熱運(yùn)動(dòng)中接近，懸浮顆粒表面過(guò)剩的負(fù)電荷將吸引絮凝劑表面可流動(dòng)的反號(hào)離子向該點(diǎn)移動(dòng)，此時(shí)絮凝劑分子就象一條反號(hào)離子的“導(dǎo)管”，反號(hào)離子從“導(dǎo)管”中流向懸浮顆粒，中和一部分顆粒表面電荷。

在這一過(guò)程中，由于 Fe3 比 Ca2 有較大的正電荷數(shù)和較小的離子半徑，導(dǎo)致 Fe3 離子在“導(dǎo)管”中流動(dòng)性下降，無(wú)法有效地降低高嶺土顆粒表面 zeta 電位。對(duì) Pseudomonas sp.所產(chǎn)絮凝劑的絮凝研究中發(fā)現(xiàn)：添加 Fe3 不能有效提高絮凝活性，但電荷數(shù)較低的 Fe2 卻能有效提高絮凝活性。

（3）由于電荷中和的作用，降低了膠體顆粒表面的 zeta 電位，同時(shí)使高分子與顆粒間相互連接。按此步驟高分子能與多個(gè)固體顆粒橋連，最后形成大絮體。

 當(dāng)金屬離子濃度過(guò)高時(shí)，一方面顆粒表面聚集了過(guò)多的金屬離子，導(dǎo)致其表面電荷下降；對(duì)于絮凝劑，分子中帶負(fù)電荷的基團(tuán)所帶電荷與金屬陽(yáng)離子發(fā)生電中和，分子內(nèi)靜電排斥作用降低，在溶液中絮凝劑分子不再具有伸展的結(jié)構(gòu)，甚至金屬離子可能使絮凝劑也帶上了正電荷，出現(xiàn)絮凝活性下降。

這一模型僅初步反映了金屬離子對(duì)絮凝劑協(xié)同作用產(chǎn)生絮凝的過(guò)程，沒有考慮絮凝劑對(duì)顆粒的網(wǎng)捕、吸附等作用，也沒有考慮金屬離子在溶液中的形態(tài)等因素的影響。

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)從微生物菌落的形態(tài)入手，快速分離了一株產(chǎn)絮凝劑的微生物；考察并比較了培養(yǎng)基中碳源、氮源對(duì)絮凝活性的影響，一定濃度的 Cu2 、Fe3 、Zn2 離子對(duì)絮凝活性有抑制作用；Na+、Mg2 、Ca2 對(duì)絮凝活性有促進(jìn)作用；為保證較好的絮凝活性，培養(yǎng)基起始 pH值應(yīng)控制在 5 ~ 8.5 之間；探討高嶺土溶液中添加的金屬陽(yáng)離子種類和濃度對(duì)絮凝活性的影響，并對(duì)該微生物絮凝劑絮凝過(guò)程模型作了簡(jiǎn)要的推測(cè)。來(lái)源：谷騰水網(wǎng)

參考文獻(xiàn)：（略）